维药睡莲花生药学检测及其没食子酸含量测定

陈 伟，古孜丽阿依·库尔班，王晓敏，刘 利，周 凡*

(1.新疆华世丹药物研究有限责任公司,新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

维吾尔药材睡莲花为睡莲科植物雪白睡莲NymphaeacandidaPres1.的干燥花，维药名尼鲁法尔。《药物之园》记载睡莲花具有治疗小儿惊风、风热感冒所致头疼及咳嗽等作用[1-2]；《本草再新》载其具有“清心凉血，解热毒，治惊痫，消湿去风，治疮疥”等诸多功效[3]。现代药理研究表明，睡莲花所含的多元酚、没食子酸和芦丁类成分具有抗氧化、保护肝脏损伤、调节血压紧张素释放等药理作用[4]。睡莲花在现代药物(如维药祖卡木颗粒等[5])中的应用也日趋广泛。目前有关睡莲花的研究报道多集中于其化学成分的研究[6]，关于其质量控制方面的报道较少，未见相关性状测量数据及花苞切片的显微鉴别[7]，高效液相图谱分离度不高、峰形特异性不明显[8]。因此，作者按照《中华人民共和国药典》2015版第一部附录方法对睡莲花药材进行分析，对睡莲花花苞切片进行显微鉴别，对睡莲花药材进行薄层色谱(TLC)鉴别，并构建睡莲花中没食子酸含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，以期进一步提高其质量控制水平。

1 实验

1.1 药材

睡莲花：批号H30180801、H30163104，新疆维麦迪森药业； 批号16071001，新疆本草堂药房。

1.2 试剂与仪器

没食子酸对照品，批号110831-201605，中国食品药品研究院；乙酸乙酯，批号20170104，天津红岩试剂厂；环己烷，批号20160213，天津斯巴夫化工有限公司；甲酸，批号20160820，天津大漠化学试剂厂；色谱级甲醇，批号T20110922，国药集团化学试剂有限公司；色谱级磷酸，批号631-61-8，上海提坦实业有限公司。

LC-20AD型高效液相色谱仪，日本岛津； FA1004型电子分析天平，上海舜平科学仪器有限公司；SK33000CHC型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；WFH-203BCN型薄层分析仪，上海精细仪器有限公司；FP40型马弗炉，北京永光明医疗仪器有限公司；2BE2000型倒置显微镜，重庆光电仪器有限公司。

2 结果与讨论

2.1 睡莲花药材分析结果

按照《中华人民共和国药典》(2015年版)第一部附录方法，测定3批睡莲花药材70%乙醇浸出物的水分、总灰分、酸不溶性灰分及没食子酸等含量，结果见表1。

表1 睡莲花药材的分析结果

Tab.1 Analytic results ofNymphaeacandidaPresl.

批号花苞质量g水分%总灰分%酸不溶性灰分%浸出物%没食子酸mg·g-1H301808010.707.6010.612.6739.341.55H301631041.186.1910.601.6134.971.31160710010.376.489.612.6724.631.44平均值0.756.7510.272.3232.981.43

2.2 睡莲花花苞切片的显微鉴别

按照《中华人民共和国药典》(2015年版)第一部附录方法，对批号H30180801的睡莲花药材粉末进行显微鉴别，结果见图1。同时，对睡莲花花苞进行徒手切片，经水合氯醛加热透化后进行显微鉴别，结果见图2。

a.非腺毛 b.螺纹导管 c.星状石细胞 d.花粉 e.支持细胞 f.木纤维

a.星状石细胞 b.螺纹导管 c.内表皮层 d.外表皮层

从图1可知，睡莲花药材粉末中有大量非腺毛。从图2可知，睡莲花花苞切片内外表皮层间夹杂大量星状石细胞，表皮下层有大量导管，表皮细胞狭长，气孔为长圆形。

2.3 睡莲花药材的薄层色谱鉴别

取3批睡莲花药材粉末(过4号筛)各1.0 g，加甲醇6 mL，超声(功率180 W，频率53 kHz) 40 min，过滤，滤液作为供试溶液。取没食子酸对照品适量，加甲醇制成0.5 mg·mL-1对照溶液。分别吸取供试溶液和对照溶液各10 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶6∶1，体积比)为展开剂，饱和，展开。取出晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，晾干至斑点清晰，如图3所示。

a.没食子酸对照品 b.睡莲花(H30163104) c.睡莲花(H30180801) d.睡莲花(16071001)

2.4 睡莲花中没食子酸含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipe×DB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.05%的磷酸(5∶95，体积比) ；检测波长271 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.4.2 对照溶液的配制

精密称取5.0 mg没食子酸对照品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.50 mg·mL-1的对照储备液。再精密吸取储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得50.0 μg·mL-1对照溶液。

2.4.3 供试溶液的配制

精密称取3批睡莲花药材粉末(过4号筛)各1.0 g，分别置于具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL，称量；超声(功率180 W，频率53 kHz)20 min，放冷，再称量；用甲醇补足损失质量，过0.45 μm滤膜，滤液作为供试溶液。

2.4.4 HPLC图谱

没食子酸对照溶液和睡莲花供试溶液的HPLC图谱如图4所示。

2.4.5 线性关系考察

精密吸取对照储备液适量，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度(μg·mL-1)分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5的对照溶液。精密吸取上述各溶液10 μL，按色谱条件进样分析。以浓度(μg·mL-1)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线(图5)，拟合得没食子酸线性回归方程：y=65753x+11842,R2=1。结果表明，没食子酸浓度在1.562 5～100 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图4 没食子酸对照溶液(a)和睡莲花供试溶液(b)的HPLC图谱

2.4.6 精密度实验

精密吸取没食子酸对照溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，没食子酸峰面积的RSD为0.4072%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性实验

取睡莲花药材(批号H30180801)供试溶液，于室温下分别放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后进样检测。结果显示，没食子酸峰面积的RSD为0.9754%，表明睡莲花供试溶液在室温下放置24 h仍稳定。

图5 没食子酸标准曲线

2.4.8 加标回收率实验

精密称取6份已知含量的睡莲花药材粉末(批号16071001)0.05 g，精密加入25 μg·mL-1没食子酸对照溶液2.5 mL，按2.4.3制备供试溶液，按色谱条件进样检测，结果见表2。

表2 没食子酸加标回收率(n=6)

Tab.2 Adding standard recovery of gallic acid(n=6)

序号称样量/g样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%10.05070.06970.06250.131498.7620.05020.06900.06250.1322101.0830.05030.06920.06250.128695.1340.05100.07010.06250.131798.5750.05050.06940.06250.131599.3360.05000.06880.06250.130298.32

由表2可知，没食子酸的平均加标回收率为98.53%，RSD为1.98%(n=6)。

2.4.9 样品测定

取3批睡莲花药材样品，按2.4.3方法制备供试溶液，按色谱条件进样测定，计算得到3批睡莲花药材中没食子酸平均含量为1.43 mg·g-1。

2.5 讨论

(1)由于缺乏睡莲花花苞切片显微鉴别的文献报道，而其粉末显微结构与其它类似莲花接近，无法从整体上区分睡莲花与伪品的显微结构差异。本实验在生药学检测基础上，对睡莲花花苞切片进行了显微鉴别，结果显示，睡莲花花苞切片为典型的“三明治”结构，上下层有大量的表皮细胞和支持细胞，中间分布大量特异性的星状石细胞，可作为睡莲花的专属鉴别项目。

(2)睡莲花花苞的主要成分有烟花苷、多元酚、没食子酸和槲皮素等；在睡莲花花朵的13种乙酸乙酯提取物中，没食子酸和槲皮素具有显著保护肝脏损伤作用(40.12%)，其抑制DPPH自由基的IC50值分别可达1.78 μg·mL-1和1.97 μg·mL-1[12]。由于没食子酸具有易被氧化的特性，本实验比较了提取溶剂、提取方式、料液比和提取时间对没食子酸含量的影响。结果发现，相比纯水和乙酸乙酯，没食子酸在甲醇溶液中更稳定，72 h内含量无显著降低；超声提取和加热回流提取对没食子酸含量影响不大；料液比为1∶10(g∶mL)时没食子酸含量最高；超声20 min时没食子酸含量最高，且无氧化产物杂质干扰。

(3)在睡莲花药材薄层色谱鉴别中，本实验对比了石油醚∶乙酸乙酯、环己烷∶乙酸乙酯∶甲酸两种展开体系。结果发现，后者斑点更清晰，无拖尾现象。基于此，选择甲醇-1%冰乙酸、甲醇-0.05%磷酸进行流动相对比实验。结果发现，流动相甲醇-0.05%磷酸的pH值更低，离子强度更高，在低波长时对本底影响更小，没食子酸色谱峰的分离度相应更高。

3 结论

维药睡莲花具有降热止咳、益心护脑、祛除“乃孜来”等多种功效，对感冒、心血管疾病、咽炎及肝炎有一定疗效[9-10]。但目前国内上市的以睡莲花为主药的药物只有维药祖卡木颗粒(已被纳入医保目录[11])。究其原因，可能是睡莲花质量控制标准的不够完善。目前，睡莲花质量控制标准只有《中华人民共和国卫生部药品标准(维吾尔药分册)》，检测方法仅为显微鉴别[2]。为提升维药睡莲花的质量控制标准，按照《中华人民共和国药典》(2015年版)第一部附录方法对睡莲花药材进行分析，对睡莲花花苞切片进行显微鉴别，对睡莲花药材进行TLC鉴别，并构建睡莲花中没食子酸含量的HPLC检测方法。结果表明，睡莲花花苞切片显微形态特征明显，睡莲花药材粉末特征细胞显微形态清楚；TLC图谱斑点清晰，Rf值与对照品一致；没食子酸浓度在1.562 5～100 μg·mL-1之间与色谱峰面积呈良好线性关系(R2=1)，精密度实验RSD为0.4072%,平均加标回收率为98.53%(RSD=1.98%,n=6)。该研究补充了睡莲花花苞切片的显微鉴别，新建了睡莲花的TLC鉴别，优化了睡莲花中没食子酸含量的HPLC检测方法。