PBD- BBD优化大枣保质工艺

杨莉杰，张苹苹，汪轩羽，李喜宏

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院， 天津 300457)

灵武长枣是宁夏特有优良鲜食的大枣品种[1]，呈长椭圆形，营养丰富、酸甜适宜，含有多种有机酸、糖类、矿物质及维生素等，素有“百果之王”的称号[2]。2016年，年产量高达2.1万t，种植面积为9 466.67 hm2，挂果面积达3 866.67 hm2，产值近亿元[3]。由于鲜枣(水分含量50%以上)鲜食期短，易萎蔫软烂，约70%的鲜枣被制成干枣。针对干枣含糖量高易虫蛀长霉难以即食，含水量低口感坚硬难以咀嚼，免洗枣市场份额小等严重制约着产业发展的问题，文章以灵武长枣干枣为原料，杀菌率为响应值，通过Plackett- Burman design(PBD)和Box-Behnken design(BBD)试验相结合的方法，对影响干枣保质的工艺条件进行优化，得到杀菌率较优的保质工艺，使干枣(水分含量18%左右)变成免洗枣(水分含量25%～35%)，延缓了微生物的生长，使菌落总数达到免洗标准，旨在为免洗枣产业化发展提供理论依据。

目前，国内外学者多研究鲜枣的保鲜，如气调保鲜[4-5]、保鲜膜保鲜[6]、涂膜保鲜[7-8]、保鲜剂保鲜[9-13]，而对干枣保质研究几乎没有。该文在单因素基础上，通过PBD试验从诸多影响干枣保质的因素中筛选出主要影响因素[14]，通过BBD试验优化干枣的保质工艺参数，使其达到免洗标准[15]，实现干枣贮藏安全、低价、高效，以期为产业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵武长枣干枣(二级枣)，宁夏中玺枣业股份有限公司；ε-聚赖氨酸盐酸盐(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

PAL- 1型手持式折光仪，日本ATAGO株式会社；PHS- 25型数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；LS- B50L型立式压力蒸汽灭菌器，上海华线医用核子仪器有限公司；Centrifuge 5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；T6型紫外可见分光光度计，上海嘉标测试仪器有限公司；DGG- 101- 2A型电热鼓风干燥箱，天津市天宇实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1大枣前处理

准确称取灵武长枣干枣500 g，经挑选、打磨、清洗、烘烤等预处理后，制得水分含量约18%的干枣，再于75 ℃蒸馏水中浸泡20 s，浸泡料液比(g/L)1∶5，75 ℃熏蒸盒中熏蒸2.0 h(熏蒸盒为自制，采用透明塑料盒，距离底部5 cm处置一打孔孔径1 cm的PVC发泡板，下层为蒸馏水，上层覆盖保鲜膜，利用热蒸汽熏蒸大枣)，使枣果均匀吸收水分，最终得到水分含量约30%的高水分大枣。

1.3.2大枣保质工艺

针对高水分大枣，改变保质处理条件(喷涂ε-聚赖氨酸盐酸盐的质量比、杀菌方式、杀菌温度、杀菌时间、包装方式)后制得免洗大枣，将免洗大枣置于温度为(35±1) ℃，相对湿度为55%±1%的恒温恒湿培养箱里培养180 d后进行破坏性实验，测定杀菌率。同时，将未经保质处理的高水分大枣作为空白对照组，测定菌落总数[16]，设为初始值。

1.3.3单因素实验设计

针对高水分大枣，选取喷涂ε-聚赖氨酸盐酸盐的质量比(0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 g/kg)、杀菌方式(75 ℃巴氏杀菌，121 ℃反压灭菌，辐射距离30 cm、辐射功率20 W的紫外杀菌)、杀菌温度(55、65、75、85、95 ℃)、杀菌时间(5、15、25、35、45 min)、包装方式(充氮、普通、真空)，5个因素进行实验，在相对湿度为55%±1%的恒温恒湿培养箱里培养180 d后进行破坏性实验，测定杀菌率，确定优化的实验条件，杀菌率计算见式(1)。平行重复3次，结果取平均值。

(1)

式(1)中，A1为初始菌落总数,CFU/g；A2为样品菌落总数,CFU/g。

1.3.4PBD、BBD试验设计

在单因素实验的基础上，以杀菌率为响应值，对ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、杀菌方式、杀菌温度、杀菌时间、包装方式5个因素各设两个水平，进行二水平的PBD试验设计，因素水平表见表1。根据PBD试验结果，选取3个主要影响因素，根据BBD试验设计原理，以杀菌率为响应值，进行三因素三水平的响应面试验，因素水平编码表见表2。

表1 PBD试验因素水平

表2 BBD试验因素水平

1.4 数据处理

数据处理及分析采用SPSS 22.0、Design Expert 8.0.6软件进行，图表绘制采用Excel 2016进行。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比对大枣杀菌率的影响

经测定，菌落总数初始值为15 000 CFU/g。参考无核红枣标准[15]，大枣中菌落总数应不高于2 000 CFU/g。ε-聚赖氨酸盐酸盐于2003年被FDA批准为安全食品保鲜剂，是多肽生物型防腐剂，安全性高、抑菌谱广、热稳定性好，对大部分霉菌、细菌、噬菌体有抑制作用，与乳酸链球菌素相比，对革兰氏阴性菌抑制作用更显著[17-18]。

随着ε-聚赖氨酸盐酸盐含量的增加，灵武长枣的杀菌率呈先上升后下降的趋势，见图1。ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比为0.07 g/kg时，菌落总数为1 300 CFU/g，抑菌效应明显，杀菌率最高，为91.33%；0.09 g/kg时，菌落总数为1 400 CFU/g，杀菌率为90.67%，有所下降，说明继续增加ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比抑菌效果改变不明显。因此，0.07 g/kg为较优的ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比。

不同字母表示差异显著(P图1 不同质量比的ε-聚赖氨酸盐酸盐对大枣杀菌率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of ε-polylysine hydrochloride on sterilizing rate of jujube

2.1.2杀菌方式对大枣杀菌率的影响

由于紫外线的穿透能力弱，对厚度为1 cm的水层灭菌效率为90%，2 cm时灭菌效果为73%，3 cm时灭菌效果为56%[19]。而实验用大枣肉厚，紫外不易透过，抑菌效果不明显，微生物易滋生。不同杀菌方式对大枣的杀菌率(见图2)。由图2可知，反压灭菌的杀菌率最高为91.33%，巴氏杀菌次之为90.67%，而紫外杀菌的杀菌率最低为83.33%。巴氏杀菌和反压灭菌的杀菌率均在90.00%以上，说明二者均能减少大枣中微生物的滋生，二者杀菌率差异不显著，但反压灭菌(121 ℃、35 min)耗电多，考虑到经济节约，故优先选择巴氏杀菌。

不同字母表示差异显著(P图2 不同杀菌方式对大枣杀菌率的影响Fig.2 Effects of different sterilization methods on sterilizing rate of jujube

2.1.3巴氏杀菌温度对大枣杀菌率的影响

杀菌率随巴氏杀菌温度的升高而上升[20-21]。55～75 ℃时，灵武长枣的杀菌率随着巴氏杀菌温度的升高而急剧上升，75～95 ℃时缓慢上升(见图3)。75 ℃时杀菌率为90.67%，85 ℃为91.33%，95 ℃为92.67%，三者相差不大。考虑到成本的节约，选择75 ℃为优化的巴氏杀菌温度。

不同字母表示差异显著(P图3 不同巴氏杀菌温度对大枣杀菌率的影响Fig.3 Effects of different pasteurization temperatures on sterilizing rate of jujube

2.1.4巴氏杀菌时间对大枣杀菌率的影响

灵武长枣的杀菌率随着巴氏杀菌时间的延长而呈上升趋势，杀菌效果趋好，见图4。5～25 min，杀菌率随着巴氏杀菌时间的延长而缓慢升高；35 min时杀菌率急剧升高，为90.67%，较25 min时升高了4.00%；45 min时为91.33%，未有显著提高。因此，选择35 min为较优的巴氏杀菌时间。

不同字母表示差异显著(P图4 不同巴氏杀菌时间对大枣杀菌率的影响Fig.4 Effects of different pasteurization time on sterilizing rate of jujube

2.1.5包装方式对大枣杀菌率的影响

大枣含有的糖类物质暴露在空气中时，微生物会在大枣表面繁殖，降低口感，甚至影响大枣的质量安全。充氮包装及真空包装，可以阻隔空气，能较有效地防止霉菌等需氧微生物的繁殖[22-23]。充氮包装的杀菌率最高，为92.67%；而真空包装次之，为90.00%；普通包装最低，为83.33%(见图5)，说明充氮包装能减少大枣中微生物的生长。故优先选用充氮包装方式。

不同字母表示差异显著(P图5 不同包装方式对大枣杀菌率的影响Fig.5 Effects of different packing methods on sterilizing rate of jujube

2.2 PBD、BBD试验结果分析

2.2.1PBD试验结果分析

表3 PBD试验设计及结果

巴氏杀菌温度、ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比对杀菌率的影响高度显著，巴氏杀菌时间对杀菌率的影响显著；杀菌方式、包装方式对杀菌率的影响不显著。因此，选择对杀菌率影响显著的3个因素，固定杀菌方式为巴氏杀菌、包装方式为充氮包装，进行BBD试验。经Design-Expert 8.0.6数据分析，预测A为0.08 g/kg、B为70 ℃、C为40 min。

表4 PBD试验方差分析

-，差异不显著；*,P<0.05，差异显著；**,P<0.01，差异高度显著；***,P<0.001，差异极显著。

2.2.2BBD试验结果分析

由表6可知，一次项对杀菌率的影响程度由大到小依次为巴氏杀菌温度(极显著)、巴氏杀菌时间(高度显著)、ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比(显著)。且ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比与巴氏杀菌温度、巴氏杀菌温度与巴氏杀菌时间存在高度显著的交互作用。经修正不显著项后，二次多项回归方程为Y=92.42+0.63A+3.20B+0.84C-1.36AB-1.32BC-6.01A2+2.29B2-7.78C2。

表5 BBD试验设计及结果

图6 ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比及巴氏杀菌温度交互作用对杀菌率的影响Fig.6 Effect of interaction between ε-polylysine hydrochloride and pasteurization temperature on sterilizing rate

2.2.3响应面交互作用分析

通过Design-Expert 8.0.6分析，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、巴氏杀菌温度、巴氏杀菌时间3个因素之间交互作用的响应面图和等高线图，见图6、图7。

由图6可知，巴氏杀菌时间40 min时，ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比和巴氏杀菌温度对杀菌率影响的等高线为椭圆形，较密集，说明ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比与巴氏杀菌温度交互作用高度显著。固定ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比，随着巴氏杀菌温度的升高，响应值逐渐增大，但曲面弧度增加较缓。固定巴氏杀菌温度，随着ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比的改变，响应值先急剧增大而后缓慢减小，ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比为0.08 g/kg时，杀菌率最高。

表6 BBD试验方差分析

-,差异不显著；*,P<0.05，差异显著；**,P<0.01，差异高度显著；***,P<0.001，差异极显著。

图7 巴氏杀菌温度及巴氏杀菌时间交互作用对杀菌率的影响Fig.7 Effect of interaction between pasteurization temperature and pasteurization time on sterilizing rate

由图7可知，ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比为0.08 g/kg时，巴氏杀菌温度及巴氏杀菌时间对杀菌率影响的等高线为椭圆形，较密集，说明巴氏杀菌温度与巴氏杀菌时间交互作用高度显著。固定巴氏杀菌温度，随着巴氏杀菌时间的延长，响应值先增大后减小，40 min时，杀菌率最高。固定巴氏杀菌时间，随着巴氏杀菌温度的升高，响应值逐渐增大，75 ℃时，杀菌率最高。

2.2.4保质条件的优化及验证实验

通过Design-Expert 8.0.6对模型优化分析，得到优化工艺条件为ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比0.08 g/kg、巴氏杀菌温度75 ℃、巴氏杀菌时间39.85 min(考虑到实验条件的可操作性，调整为40 min)，杀菌率预测值为97.94%。在优化条件下，固定杀菌方式为巴氏杀菌、包装方式为充氮包装，进行3次重复验证实验，得到杀菌率为98.00%，与BBD试验预测结果基本一致，说明BBD优化条件具有可靠性，该模型具有实用价值。

3 结 论

本文在单因素实验的基础上，对ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、杀菌方式、巴氏杀菌温度、巴氏杀菌时间、包装方式5个影响因素，进行二水平的PBD试验设计。在PBD试验基础上，以杀菌率为响应值，选取ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比、巴氏杀菌温度和巴氏杀菌时间为影响杀菌率的3个主要因素，进行三因素三水平的BBD响应面试验，通过优化验证试验，得出优化工艺条件为ε-聚赖氨酸盐酸盐质量比0.08 g/kg，采用75 ℃、40 min的巴氏杀菌方式及充氮包装，此时杀菌率为98.00%，与预测值基本一致，说明该模型具有可靠性。产品在贮藏180 d后，其最终水分含量为26.40%，菌落总数为1 300 CFU/g，仍达到高水分含量(25%～35%)、免洗标准(菌落总数低于2 000 CFU/g)。研究结果以期为产业化发展提供理论依据。