液相色谱- 串联质谱法同时测定食品中9种甜味剂

童兰艳，代政华，肖昭竞，张丽妮，邹 孝，余文琴

(重庆市计量质量检测研究院重庆市食品安全工程技术研究中心/国家农副加工及调味品质量监督检验中心， 重庆 401123)

高甜味、低热量的甜味剂被广泛应用于食品中，且大部分甜味剂主要通过人工合成获取，如阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿力甜、纽甜等[1]。近年来研究发现人造甜味剂的长期大量摄入可能会导致高血糖、葡萄糖耐受不良、肥胖等代谢系统性疾病，易怒、抑郁、记忆衰退、阿尔兹海默症等神经系统异常[2-4]，甚至具有遗传毒性和致癌性[5-7]。

世界各国对甜味剂的使用情况规定不同，如甜蜜素在美国属于禁用食品添加剂，但欧盟和中国允许使用。爱德万甜为新型甜味剂，2017年10月20日, 国家卫生计生委发布第8号公告《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、食品添加剂环己基氨基磺酸钠 (又名甜蜜素) 等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告》正式批准爱德万甜作为食品添加剂。目前常用的食品中甜味剂的检测方法是液相色谱法[8-9]和液相色谱串联质谱法[10-12]。液相色谱法检测存在灵敏度、分别率不够高、多种甜味剂同时检测分离效果不够好等问题，液相色谱串联质谱法是同时测定多种甜味剂的较佳选择[13]。安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、爱德万甜和纽甜在食品中的使用限量见表1，这9种甜味剂在食品中被同时检测的报道较少[14-15]。

本研究建立了采用高效液相色谱- 串联质谱法同时测定食品中9种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、爱德万甜和纽甜)的快速测定方法，在满足国家标准对食品中9种甜味剂检测要求前提下，与国家标准检测方法相比，本方法操作简单、快速、高效，提高了样品的检测分析效率。另外，用本方法对5种市售食品(酒、雪糕、果冻、酸奶和糖果)中的甜味剂进行了快速检测，发现部分市售食品存在违规添加和滥用甜味剂的现象，相关部门需要对此问题进行关注。

表1 9种甜味剂的甜度及限量[6-7]

每日允许摄入量为联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估而定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Quintix 224- 1CN型电子天平，德国Sartorius公司；安捷伦1290型液相色谱- 三重四级杆串联质谱仪，美国AB公司；SB- 1500DT型超声仪，中国宁波新芝生物科技股份有限公司； VORTEX3型圆周振荡器，德国IKA公司。

乙腈，色谱纯，美国Tedia公司；甲酸、乙酸铵，色谱纯，中国成都市科隆化学品有限公司；安赛蜜纯度≥99.5%，甜蜜素纯度≥99.9%，阿斯巴甜纯度≥99.2%，三氯蔗糖纯度≥99.7%，爱德万甜纯度≥99.0%，纽甜纯度≥99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；糖精钠1 000 mg/L，中国计量院；阿力甜纯度≥99%，甜菊糖苷纯度≥99%，加拿大TRC公司。

酒、雪糕、果冻、酸奶和糖果均为市售。

1.2 标准溶液配制

1.2.1标准储备液

分别取安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖标准品于容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的标准储备液；取量甜菊糖苷标准品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的标准储备液；分别称取爱德万甜、纽甜标准品于容量瓶中，用V(甲醇)∶V(水)=1∶1溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的标准储备液。

1.2.2标准工作溶液

分别移取安赛蜜、甜蜜素、阿力甜、爱德万甜和纽甜标准储备液0.10 mL于10 mL容量瓶，用超纯水定容，制成10 mg/L混合标准溶液。分别移取糖精钠、三氯蔗糖、阿斯巴甜和甜菊糖苷标准溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，制成20 mg/L混合标准溶液。取适量的2种混合标准溶液配制安赛蜜、甜蜜素、阿力甜、爱德万甜和纽甜密度为0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、0.800、1.000 mg/L的标准工作溶液，糖精钠、三氯蔗糖、阿斯巴甜和甜菊糖苷密度为0.020、0.040、0.100、0.200、0.400、1.000、1.600、2.000 mg/L的标准工作溶液。

1.3 样品处理

1.3.1白酒样品

白酒，取样品1 g(精确至0.000 1 g)用水浴锅加热除尽乙醇，转移至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀，过0.22 μm滤膜后供HPLC- MS/MS分析。

1.3.2雪糕、果冻、酸奶、糖果样品

准确称取1 g(精确至0.000 1 g)至15 mL离心管中，加10 mLV(甲醇)∶V(水)=1∶1溶液涡旋混匀，超声30 min后，10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜后供HPLC- MS/MS分析。

1.4 仪器条件

1.4.1HPLC条件

色谱柱为：AQ- C18(100 mm×2.1 mm×3 μm)，柱温为35 ℃，进样量5 μL，流动相A为c(乙酸铵)20 mmol/L的水溶液，流动相B为φ(甲酸)0.1%的乙腈溶液，流速0.35 mL/min。洗脱梯度程序见表2。

表2 洗脱程序

1.4.2质谱条件

电喷雾离子源；离子源温度：500 ℃；电喷雾电压：-4 500 V；检测模式：多反应监测；雾化器压力：50psi(344.74 kPa)；气帘气压力：25 psi(172.37 kPa)；辅助气压力：50 psi(344.74 kPa)；碰撞气：6 mL/min。9种甜味剂的质谱检测条件见表3。

表3 9种甜味剂质谱检测条件

2 结果与讨论

2.1 分析条件优化

在条件优化过程中选用AQ- C18(100 mm×2.1 mm×3 μm)色谱柱对9种甜味剂进行分离。考察了φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸铵)0.005 mol/L的水溶液、φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸铵)10 mmol/L的水溶液和φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸铵)20 mmol/L的水溶液流动相体系，发现φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸铵)20 mmol/L的水溶液作为流动相时，9种甜味剂的峰形对称且尖锐，且目标化合物的响应值较高，最终选用φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸铵)0.02 mol/L的水溶液作为流动相。以适量浓度甜味剂混合标准溶液进样，通过对离子源模式、碰撞能量等条件进行优化，确定目标物质的离子对，结果见表3。9种标准溶液总离子流图见图1。

1.安赛蜜，2.糖精钠，3.甜蜜素，4.阿斯巴甜，5.三氯蔗糖，6.阿力甜，7.甜菊糖苷，8.爱德万甜，9.纽甜。图1 9种甜味剂标准溶液总离子流图Fig.1 Total ions chromatogram of 9 sweeteners

2.2 线性关系和方法检出限

在优化条件下测试不同浓度的9种甜味剂标准溶液，绘制标准曲线，以信噪比S/N≥3和S/N≥10计算出9种甜味剂的方法检出限和定量限，结果见表4。由表4可知，9种甜味剂的检出限为0.020～0.055 mg/kg，定量限为0.06～0.15 mg/kg。

2.3 食品中9种甜味剂的测定

对重庆市售的白酒、雪糕、果冻、酸奶和糖果各6个样品进行了前处理，结果表明样品中均未检出爱德万甜，说明目前爱德万甜还未在食品中广泛应用。但是在检测样品中有一个白酒样品的甜蜜素超标，含量为0.72 mg/kg、一个白酒样品的三氯蔗糖超标，含量为1.04 mg/kg；一个白酒样品的安赛蜜，含量为38.2 mg/kg，在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定蒸馏酒中不允许添加任何甜味剂；一个酸奶样品检出安赛蜜，含量为4.30 g/kg，超过GB 2760—2014中限量0.35 g/kg；一个果冻样品中检出阿力甜0.37 g/kg，超过GB 2760—2014中限量为0.1 g/kg，以上有说明食品市场存在违规添加和滥用甜味剂的现象，相关部门需要对相关现象进行关注。

表4 9种甜味剂的标准曲线及检出限

表5 食品中9种甜味剂的回收率

n=6。

2.4 回收率和精密度测定

分别称取白酒、雪糕、果冻、酸奶和糖果阴性样品，每种样品中添加低、中、高3个浓度水平的甜味剂，每个水平下进行6次平行实验，结果见表5。结果表明，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、纽甜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷和爱德万甜在酒、雪糕、果冻、酸奶和糖果中加标回收率为90.6%～111.5%，相对标准偏差均小于为6.0%。

3 结 论

本研究建立高效液相色谱- 串联质谱法同时测定食品中9种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、爱德万甜和纽甜)的快速测定方法，应用本方法对食品中9种甜味剂进行检测，整个实验操作简单、快速、高效，在满足国家标准对食品(白酒、饮料、果冻、酸奶、糖果)中9种甜味剂检测要求前提下，与国家标准检测方法相比，大大提高了样品的检测分析效率。应用本方法对5种食品中9种甜味剂进行检测，发现食品市场存在违规添加和滥用甜味剂的现象，相关部门需要对相关现象进行关注。实验证实建立食品中甜味剂的痕量检测提供了可靠而准确的技术手段，对规范食品添加剂在食品中的使用行为具有重要意义，同时为食品安全监管、高效检测指明高效率、高通量发展方向。