老白干香型白酒酿造微生物菌群及其与微量成分的关系

马冰涛，范恩帝，李泽霞，张煜行，张志民，陈叶福，肖冬光，郭学武,,*

(1.天津科技大学 生物工程学院/工业发酵微生物教育部重点实验室/天津市工业微生物重点实验室，天津 300457； 2.河北衡水老白干酿酒(集团)有限公司 ， 河北 衡水 053000)

中国白酒历史悠久，是世界六大蒸馏酒之一，因具备历史、品牌、价值、口感、经典等因素而跻身世界名酒之列[1]。到目前为止，中国白酒共分为12种香型，其中又以清、浓、酱、米4种香型为基本香型，其余香型则由其中2种或2种以上的基本香型复合所派生[2]，如老白干香型。有研究表明，老白干香型白酒中的主要酯类物质是乙酸乙酯和乳酸乙酯，而这两者比值高达1∶1.5至1∶2.0，远高于其他香型白酒[3]，这也正是老白干香型的独特所在。老白干香型典型代表为衡水老白干，其香气清雅、自然协调、绵柔醇和、回味悠长[4]，这不仅得益于衡水独特的气候和地理环境，更取决于其独特的大曲(纯小麦中温曲，原料不润料，不加母曲，曲柸水分含量低)[5]。

微生物在白酒酿造过程中具有举足轻重的作用，如：细菌(芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌和梭菌等)能产生酯类、有机酸、吡嗪、萜烯等微量成分，从而影响白酒的风味与品质[6]；霉菌具有较强的糖化能力、液化力以及蛋白质分解能力，也能产生少量的风味物质和风味前体物质，主要集中在醇类、酚类和呋喃类[7-8]；酵母菌对于酒精发酵以及相关酶系的产生起着重要的作用，具有较强的生香功能[8]，并且能抑制发酵过程中一些腐败微生物的繁殖[9]，同时也有研究表明，除了酯、酸、高级醇和醛外，酵母菌还能产生一些α-Terpineol等萜烯类物质[10]。白酒中的微量成分是形成各种香型白酒独特风味的直接决定性因素，同时部分微量成分还具有保健作用[11]。研究微生物与微量成分之间的关系对指导白酒生产有着重要意义。王鹏等[12]通过高通量测序技术结合顶空固相微萃取气相色谱- 质谱联用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS- SPME- GC- MS)技术，得出白酒酿造过程中的核心微生物群，认为该核心微生物群推动了风味的演变；王鹏等[13]通过高通量测序方法解析了绵甜型白酒酒醅中的微生物群落结构；孙乐平等[14]同样借助HS- SPME- GC- MS技术结合高通量测序的方法，研究了燕麦黄酒中的微生物群落结构，并分析了燕麦黄酒中的高级醇与微生物之间的关系，认为燕麦可以增加黄酒中高级醇的种类和含量。这些研究借助高通量技术很好地解析了样品中的微生物群落结构，并分析了微生物对部分风味成分的影响，但对微生物与整体风味成分的关系，以及微生物之间的相互作用分析较少。本研究正是建立在此基础上，通过高通量测序技术对老白干香型酒醅进行测序，探究白酒酿造过程中的微生物多样性和群落演替，同时利用HS- SPME- GC- MS技术监测白酒酿造过程中微量成分的组成和变化，分析酿酒过程中微生物对微量成分的贡献情况，以期为提高白酒品质、改良标准化生产提供帮助。

1 材料与方法

1.1 酒醅样品的采集

酒醅样品取自河北衡水老白干酒业股份有限公司酿酒车间，衡水老白干作为老白干香型的典型代表，其研究结果更具代表性。随机抽取一个酿酒车间，从车间再随机抽取两个班组，一个作为实验班组，一个作为对照班组。从酒醅入池第一天开始跟踪取样，取样时间点根据发酵温度变化选择[15]，分别取0、3、5、7、14、21、30 d(出池)7种样品，每种进行两次平行实验，以确保样品的代表性和稳定性。每次使用取样器取同一地缸上中下层酒醅，在无菌环境下充分混匀后四分法取样，每个样品取两份，每份50 g，一份置于-20 ℃用于微量成分分析，一份置于-80 ℃用于高通量测序。

1.2 仪器与试剂

7890A- 5975C型气相色谱- 质谱联用仪，美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取头，美国Supelco公司；HJ- 2A型磁力加热搅拌器，上海维诚仪器有限公司；FA2004型电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；20 mL顶空萃取瓶，美国Agilent公司。

色谱纯标准品：癸酸乙酯(110-38-3)、己酸乙酯(123-66-0)、乳酸乙酯(97-64-3)、乙偶姻(513-86-0)、β-石竹烯(87-44-5)、β-环柠檬醛(432-25-7)、香叶基丙酮(3796-70-1)、α-石竹烯(6753-98-6)、正构烷烃标准溶液，美国 Sigma-Aldrich 公司；乳酸(50-21-5)、乙酸(64-19-7)、己酸(142-62-1)、乙醛(75-07-0)、异戊醛(590-86-3)、愈创木酚(90-05-1)、苯酚(108-95-2)、苯乙醇(60-12-8)、乙醇(64-17-5)、乙酸乙酯(141-78-6)、异戊醇(123-51-3)、2,3-丁二醇(513-85-9)、川芎嗪(1124-11-4)，百灵威科技有限公司。NaCl (分析纯)，天津市化学试剂一厂。

1.3 实验方法

1.3.1微量成分的检测

参照王敏等[16]测定白酒中风味物质的方法，使用顶空固相微萃取配合气相色谱- 质谱联用仪检测酒醅中风味成分，优化部分参数。

1.3.1.1 色谱条件的确定

HP- 5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升温程序：40 ℃保持30 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。注射模式：不分流进样。载气：He(>99.999%)。载气流量1 mL/min，解吸附8 min。

1.3.1.2 质谱条件的确定

离子源为EI源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，进样口温度250 ℃，电子倍增器电压870 V，质量扫描范围m/z35～500 u。质谱分析数据库为NIST14(Agilent公司)。

1.3.1.3 萃取方法

10 g酒醅水浴加热浸提，提取温度80 ℃，乙醇体积分数75%，提取时间1.5 h，料液比(g/mL)1∶15。在顶空瓶中加入5 mL酒醅提取液，2.5 g NaCl，采用固相微萃取方法，通过萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)水浴加热萃取，吸附时间60 min，萃取温度60 ℃，平衡时间5 min。

1.3.2保留指数的计算

取0.1 μL正构烷烃混标，按照1.3.1的方法进样分析，记录每个正构烷烃对应的保留时间和样品各色谱峰的保留时间，各挥发性化合物保留指数的计算如式(1)。

(1)

式(1)中：RI为挥发性化合物的保留指数；n为该化合物碳标的原子数；RTx为该化合物的保留时间；RTn为碳数n正构烷烃的保留时间；RTn+1为碳数n+1正构烷烃的保留时间。

1.4 高通量测序

1.4.1基因组DNA的提取和PCR扩增

采用SDS方法对样本的基因组进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。 取适量的样本DNA于离心管中，用无菌水稀释样本至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物(Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer, New England Biolabs公司)和高效高保真酶进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性。细菌所用引物为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R (5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，该引物针对细菌和古细菌16S rRNA基因序列中的V3、V4可变区进行扩增；真菌测序区域选择ITS2区域，引物为ITS3F (5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

1.4.2PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×TAE 2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。

1.4.3文库构建和上机测序

使用建库试剂盒(Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns, ThermoFisher 公司)进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Ion S5TMXL(ThermoFisher公司)进行上机测序。测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units )聚类和物种分类分析。根据OTUs聚类结果，对OTUs进行丰度、α和β多样性分析。对不同样本在97%一致性阈值下的α多样性分析指数(Shannon、Chao1、样品覆盖率)进行统计。

1.5 微量成分热图的绘制和聚类分析

热图和聚类分析可以清晰显示制曲过程中各种微量成分的动态变化规律，同时可以看出各个样本之间的相似度。使用MSD化学工作站处理气质联用数据，得到微量成分在各个样本中的含量和种类，在初始阈值为12的前提下筛选匹配度大于800的成分作为有效数据。使用OmicShare云平台(https:∥www.omicshare.com)对所有样本进行聚类分析和热图绘制。

1.6 核心微生物与微量成分的关系确定

参考王鹏等[12]研究中国白酒发酵过程中的核心微生物群及其与环境因子关系的方法，将所有样品中检测到的风味成分和在属水平选取的丰度top20的细菌和真菌作为变量，7个时间段检测到的风味成分含量和微生物含量(取平行样品的均值)分别对应每个变量，通过SPSS 24.0计算微生物与风味物质之间的Spearman相关系数(ρ)，选取系数绝对值大于0.8且相关性显著的部分作为研究微生物与微量成分相关性的可视化对象；对于微生物之间的共现性分析，计算微生物之间的Spearman 相关系数，选取系数绝对值大于0.8且相关性显著的部分作为可视化对象。使用Cytoscape 3.6.1软件对酒醅微生物与微量成分的相关性和微生物之间的相互关系进行可视化图形绘制，分析他们之间的关系，明确微生物对微量成分的贡献情况。

top20的选取：选取7个时间段样品丰度排名前两位的微生物共14个，继续对比7个样品丰度排名第三的微生物，选取丰度排名前6的微生物(如有相同微生物，则选取下一排名)。所有微生物丰度均是每个时间段平行样品的平均值。top10的选取方法与top20相同。

2 结果与分析

2.1 微生物多样性分析

利用高通量测序技术对老白干香型白酒酿造过程中的微生物进行多样性分析。对测序结果进行嵌合体过滤，得到有效数据，后续所有分析将建立在有效数据的基础上进行。细菌测序结果共得到1 076 932条高质量的序列，平均每个样本具有76 923±19 479条序；真菌测序结果共得到345 007条高质量的序列，平均每个样本具有24 643±14 856条序列。测序数据处理结果见表1，所有样本的样品覆盖率均大于0.998，保证了测序得到的数据质量科学可靠[17]。

对每个样本的有效数据进行α多样性分析，可以反映白酒酿造过程中微生物群落的丰富度和多样性[18]。选取Chao1和Shannon两个指数进行分析(表1)(均一化时选取的数据量：cutoff=43 407)。Shannon指数用来估算样品中微生物的多样性，值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数是用Chao1算法估计群落中含OTU数目的指数，在生态学中常用来估计物种总数，值越大代表物种总数越多。

表1 测序数据处理统计

通过对有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析，根据物种注释结果，选取每个样本在门水平(phylum)和属水平(genus)上top10的微生物，生成微生物相对丰度柱形累加图(图1)，以便直观查看各样本在不同分类水平上，相对丰度较高的微生物及其比例。从图1可知，细菌门主要包括Firmicutes和Proteobacteria，其中Firmicutes(50.63%～99.13%)为整个发酵过程中的优势细菌门，Proteobacteria(34.81%)、Cyanobacteria(7.03%)、Actinobacteria(3.43%)只在0 d占据一定优势，随着发酵时间的延长，几乎消失，这些菌可能来自大曲，随着发酵时间的延长，发酵环境不利于它们生长，故逐渐丧失优势；优势真菌门则主要为Ascomycota(83.39%～93.78%)、Mucoromycota(3.38%～15.16%)和Basidiomycota(0.83%～11.33%)，在整个发酵过程中相对比较稳定。在属水平上，总共检测到310个细菌属和59个真菌属，其中细菌属Lactobacillus(13.90%～95.14%)、Pediococcus(1.08%～73.43%)、Weissella(0.20%～10.55%)和真菌属Saccharomycopsis(20.67%～56.40%)、Issatchenkia(20.67%～49.63%)、Rhizopus(2.27%～15.26%)、Trichosporon(2.22%～11.19%)、Candida(1.83%～7.77%)、Aspergillus(3.55%～5.84%)在整个发酵过程中占据相对较大优势。

图1 酿造过程中的微生物在门水平和属水平的分布情况Fig.1 Distribution of microorganisms at phylum and genus levels during brewing

β多样性分析是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。首先根据所有样本的物种注释结果和OTUs的丰度信息，将相同分类的OTUs信息合并处理得到物种丰度信息表，同时利用OTUs之间的系统发生关系，进一步计算Unifrac距离(Unweighted Unifrac)[18-19]。Unifrac 距离是一种利用各样本中微生物序列间的进化信息计算样本间距离，两个以上的样本，则得到一个距离矩阵，然后利用OTUs的丰度信息对Unifrac距离(Unweighted Unifrac)进一步构建Weighted Unifrac距离[20]。选用 Weighted Unifrac 距离和 Unweighted Unifrac 距离两个指标来绘制热图，以衡量两个样本间的相异系数，其值越小，表示这两个样本在物种多样性方面存在的差异越小。β多样性分析结果见图2，发酵0～3 d是微生物群落变化最大的时候，尤其是细菌。酒醅在入池后开始迅速升温，到第3天左右达到最高温度[15]，巨大温度变化可能是导致微生物群落发生变化的重要影响因素。随着发酵时间的延长，发酵温度逐渐趋于平缓，微生物群落结构也趋于稳定。

同一方格中，上下两个值分别代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离。图2 β多样性分析热图Fig.2 Heatmap of beta diversity

β多样性分析(图2)结合物种聚类分析(图1)可知，老白干香型白酒在酿造过程中，微生物种类和数量变化呈现一定规律。0～3 d部分微生物丰度变化较大，0 d和3 d之间的Unifrac距离是整个发酵过程中相邻样本间Unifrac距离的最大值，是微生物群落结构发生重大变化的时期，这个阶段发酵温度迅速上升，并逐渐到达最高温度，能够适应发酵环境的微生物存留下来，形成逐渐稳定的群落结构。3～21 d微生物丰度逐渐增大，相邻两样本之间Unifrac距离较小，且变化不大，说明微生物群落结构趋于稳定，微生物开始迅速繁殖、代谢，产生大量风味物质，是影响白酒品质的关键环节。21～30 d发酵接近尾声，部分微生物丰度减小，但相邻两样本之间Unifrac距离较小，说明随着发酵时间的延长，乙醇浓度的逐渐升高，微生物生长受到抑制，但群落结构并没有太大变化。

2.2 微量成分检测结果分析

监测酿造过程中微量成分的变化情况，能够更好地了解微生物群落变化所带来的影响。通过HS- SPME- GC- MS技术，检测酒醅中的微量成分，实验结果如表2。由表2可知，酒醅中共检测到可挥发性微量成分120种，其中包含37种酯类物质、10种酸类物质、10种酮类物质、10种醛类物质、19种醇类物质、6种萜烯类物质、14种碳氢类化合物、6种酚类物质、5种吡嗪类物质和3种呋喃类物质。通过半定量分析可以发现，酒醅中含量较多的微量成分主要为酯类物质，其中以乙酸乙酯和乳酸乙酯为主，两者比例大约在1∶1.2至1∶1.5，与丁云连等[3]报道的结果相近。

同时，检测结果中还发现了6种萜烯类物质。萜烯类化合物是白酒中一种重要的微量风味成分，由谷物和豆类材料发酵过程中的各种酵母菌产生，是自然界化合物中结构多样性最为丰富的物质[21]。萜烯类化合物功能较多，包括抗菌活性、抗病毒活性、抗氧化活性、镇痛活性、助消化活性和抗癌活性，等等，此次发现的α-石竹烯就具有抗氧化活性[22]。

对检测到的微量成分进行热图绘制，并进行聚类分析，结果见图3。可以看出，微量成分变化趋势较为明显，0～3 d是微量成分种类增加的一个小高峰，这可能与微生物群落结构变化较大有关；3～14 d微量成分种类变化较小，结合酒醅中的微量成分相对含量(见表2)可以发现，这个阶段是大部分微量成分逐渐增加的过程；14～21 d是微量成分种类变化的另一个高峰，大量酯类物质在这一阶段合成，酒醅中的微量成分进一步丰富起来；21～30 d微量成分种类变化不大，数量持续增加，部分原料中带来的微量成分趋于消失。

2.3 微生物核心群落与微量成分的关系

为进一步研究微量成分与微生物之间的相关性，对两者进行相关性分析。通过计算微生物与微量成分之间的Spearman相关系数，绘制相关性网络图，见图4。由图4可知，Lactobacillus是与微量成分连接数最大的一个属(42个)，与它相关的微量成分包含了大部分的酯类、醇类和酸类，还有少量的醛类、芳香类和萜烯类。Lactobacillus属于乳酸杆菌，对白酒风味有较大影响，是白酒酿造过程中的核心微生物[23]。有研究表明，L.acetotolerans能够促进清香型白酒中酯类物质的形成，如果在发酵过程中缺少这种菌，会导致发酵滞后，且产出的白酒中酯含量也较低[24]。此外，Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella与微量成分也有很大相关性(连接数分别为30、39、32、26、32、33)。因此，由Lactobacillus、Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella形成的微生物群对微量成分贡献较大。

通过计算微生物之间的Spearman相关系数，选取系数绝对值大于0.8且相关性显著的部分进行微生物之间的共现性分析，以此探究微生物之间的相关性。微生物间的共现性见图5，分析共得到28个有效节点和61个边。连接数较多的菌属包括Pediococcus、Thelebolus、Fusarium、Saccharomyces、Lactobacillus、Yamadazyma、Bacillus和Staphylococcus，主要分布在Bacillales、Saccharomycetales和Lactobacillales三个目中。结合图4(a)所得结论，“由Lactobacillus、Bacillus、Fusarium、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thelebolus和Weissella形成的微生物群对微量成分贡献较大”，可以得出：在老白干酒酿造过程中，对微量成分具有较大贡献的核心微生物群由Bacillus、Fusarium、Lactobacillus、Staphylococcus和Thelebolus组成。

表2 酒醅中的微量成分

续表2

续表2

“-”表示未检测到该物质；相对含量值为“平均值±标准偏差”。

图3 酿造过程中微量成分变化的热图Fig.3 Heatmap of trace components during fermentation

节点大小表示此节点连接数的多少；实线代表极显著，虚线代表显著；黑线代表正相关，红线代表负相关；连接线的粗细代表相关性的强弱。图4 微生物和微量成分的相关性Fig.4 Correlation between microbial genera and trace components

已有研究表明：酱香型酒醅样品中的细菌主要是Lactobacillus、Lactococcus、Acetobacter、Bacillus、Lysinibacillus，窖内发酵酒醅中细菌的优势菌是乳杆菌属Lactobacillus，是酱香型白酒窖内发酵过程中最常见的重要微生物菌群[25]；浓香型酒醅中乳杆菌占据绝对优势，但丰度较低的梭菌纲微生物对酒醅风味物质贡献却巨大[26]；清香型酒醅中的绝对优势菌为Acetobacteraceae、Lactobacillaceae、Candida和Pichiaceae[27]。结合本次研究结果可以看出，老白干香型酒醅中的核心微生物群与其他香型有较大区别，这很有可能是形成老白干香型白酒独特风味的重要因素。

节点大小表示此节点连接数的多少；实线代表极显著，虚线代表显著；黑线代表正相关，红线代表负相关；连接线的粗细代表相关性的强弱。图5 微生物之间的共现性Fig.5 Correlation of co-occurring microbial genera

通过提取微生物和微量成分的第一主成分进行相关性分析，可以验证微生物与微量成分是否具有相关性，从而验证所得结论的科学性[12]。选取1.6中筛选出的丰度top20的细菌和真菌，对比7个取样时间下这些菌的相对丰度，提取第一主成分作为微生物第一主成分；选取1.6节中筛选出的微量成分，对比7个取样时间下这些微量成分的相对含量，提取第一主成分作为微量成分第一主成分。最后计算两个第一主成分之间的相关性，结果如图6。由图6可知，微生物与微量成分具有显著相关性(R2=0.602 1，ρ=0.797，P<0.05)，说明本次研究所得的核心微生物群对微量成分具有一定贡献。

图6 微生物第一主成分与微量成分第一主成分的相关性Fig.6 Correlation between microorganisms PC1 and trace components PC1

3 结 论

本研究通过高通量测序技术，分析了老白干香型白酒酿造过程中微生物多样性及其演替规律，共得到310个细菌属和59个真菌属，其中优势细菌属为Lactobacillus、Pediococcus、Weissella，优势真菌属为Saccharomycopsis、Issatchenkia、Rhizopus、Trichosporon、Candida、Aspergillus。通过顶空固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用技术检测了酿造过程中微量成分的变化，共得到120种微量成分。0～3 d和14～21 d微量成分种类迅速增加，其他时间是微量成分含量逐渐增加的过程，其中21～30 d部分原料中带来的微量成分趋于消失。最后通过分析微生物与微量成分之间的相关性以及微生物之间的相互关系，探明微生物对微量成分的贡献情况。结果表明，以Lactobacillus为主，结合Bacillus、Fusarium、Staphylococcus和Thelebolus共同形成的核心微生物群对老白干香型白酒酿造过程中的微量成分具有一定贡献。希望本研究能够为研究老白干香型白酒的品质与酿酒微生物之间的关系提供一定的理论依据和参考。