铜绿假单胞菌重组Bb（pGEX⁃OprF⁃I）疫苗诱导的保护力及体液免疫应答

梁诚诚 李文桂

重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所（重庆400016）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是 一种常见的Gram阴性致病菌，具有基因组多样性和多环境持续存在的特点，可引起广泛的院内感染，如呼吸机相关性肺炎、败血症、尿路感染和器械相关性感染［1-3］。Pa还影响宿主的损伤修复机制，使细菌更易定植和更难清除，从而发展为迁延不愈的慢性感染，增加患者的死亡风险和经济负担。由于Pa生物膜形成、β-内酰胺酶产生和抗生素滥用等内在和获得性的抗性机制［4-5］，使得耐药菌株增多，世界卫生组织已将其归类为耐药的优先病原体，抗菌治疗愈发艰难［6-7］。单一的抗生素化疗往往不能解决问题，疫苗研制是有效的替代手段之一。

目前Pa疫苗的种类繁多，如外膜蛋白疫苗、脂多糖疫苗、鞭毛疫苗和菌毛疫苗等，但这些疫苗仍存在安全性或有效性等问题，因此，有必要研究新型疫苗［8］。外膜蛋白F-I（outer membrane protein F⁃I，OprF⁃I）是一种具有开发前景的疫苗分子［9］。RELLO等［10］将重组蛋白OprF⁃I免疫机械通气的ICU患者，在初免后14 d发现血清IgG抗体升高，侵袭性感染率减低，提示该蛋白具有良好的免疫原性。两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，Bb）具有益生菌和稳定表达外源抗原的作用，使其成为一种新型疫苗载体［11］。本研究在成功构建重组Bb（pGEX⁃OprF⁃I）疫苗的基础上［12］，将其免疫小鼠，观察其诱导的保护力及体液免疫应答，从而为研究其保护性免疫机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 铜绿假单胞菌重组Bb（pGEX⁃OprF⁃I）疫苗由重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究构建及保存，见文献［12］；21只6～8周龄清洁级雌性BALB/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA购自美国Southern Biotech公司；Pa抗原及感染的鼠血清由本研究所保存；LB（Luria⁃Ber⁃tani，LB）培养基和MRS（Man⁃Rogosa⁃Sharpe，MRS）固体和液体培养基由本研究所制备。酶标仪购自Scientific Thermo公司。本研究通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准，整个研究过程符合伦理学要求（伦理批准号：2018015）。

1.2 动物免疫及攻击方案 将21只BALB/c小鼠随机分为3组：疫苗组［rBb（pGEX⁃OprF⁃I）］、空载体对照组［rBb（pGEX⁃1λT）］和Bb对照组，每组7只，均口采用服灌胃免疫途径。将5×108CFU疫苗重悬于100μL的MRS培养液，每日接种1次，每周连续3 d，共3周。在初次接种后4周，将5×107CFU PA01株重悬于10μL的LB培养液，进行1次性滴鼻攻击。

1.3 肺细菌负荷计数 在攻击感染后2周处死小鼠，无菌取1 g肺组织，匀浆稀释涂皿，37℃培养48 h后计数肺细菌菌落。

1.4 常规ELISA检测小鼠血清IgG及其亚类、IgE和IgA抗体水平 分别在接种前和初免后4周采集小鼠尾静脉血，PA01株攻击后2周摘除眼球取血，分离血清后-20℃冻存待查。常规ELISA法检测IgG及其亚类、IgE和IgA抗体。以1μg/孔Pa抗原包被96孔酶标板（4℃过夜），封闭2 h后，先后加入小鼠血清（1∶100稀释）和HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA（1∶5 000稀释），反应结束后用酶标仪检测血清A492 nm值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行分析，实验结果用均数±标准差表示，肺细菌计数用（Ig CFU/g）表示，多组间比较用单因素方差分析和LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺细菌的菌落计数 疫苗免疫及PA01株攻击后，小鼠的肺细菌菌落计数结果显示疫苗组、空载体对照组和Bb对照组的菌落数分别为（7.43±0.03）Ig CFU/g、（8.86±0.05）Ig CFU/g和（8.87±0.05）Ig CFU/g。疫苗组的肺细菌菌落数明显低于其余两个对照组（F=2 476.634，P＜0.001），空载体对照组和Bb对照组间差异无统计学意义（t=0.016，P=0.878，表1）。

表1 疫苗免疫及PA01株攻击后小鼠的肺细菌菌落数Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX⁃OprF⁃I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

表1 疫苗免疫及PA01株攻击后小鼠的肺细菌菌落数Tab.1 The number of bacteria colonies in the lung of mice immunized with rBb（pGEX⁃OprF⁃I）vaccine and challenged with PA01 strain ±s

注：与空载体和Bb对照组比较，*P<0.01

组别疫苗组空载体对照组Bb对照组例数7 7 7肺细菌的菌落数（Ig CFU/g）7.43±0.03*8.86±0.05 8.87±0.05

2.2 免疫鼠血清IgG及其亚类、IgE和IgA的抗体水平 用常规ELISA法检测小鼠免疫前、初免后4周和攻击后2周的血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平变化情况。结果如图1（A、B、C、D、E）所示，同一时间点的不同组间比较，接种前的血清IgG及其亚类水平较低，且在3组间差异无统计学意义（IgG：F=0.310，P=0.738；IgG1：F=0.942，P=0.408；IgG2a：F=0.716，P=0.502；IgG2b：F=0.398，P=0.677；IgG3：F=0.112，P=0.895）；初免后4周和攻击后2周的疫苗组血清IgG及其亚类水平较空载体对照组和Bb对照组均明显增高（初免后4周和攻击后2周的F值分别为：IgG：F1=100.551，F2=57.536；IgG1：F1=45.063，F2=51.186；IgG2a：F1=91.861，F2=122.183；IgG2b：F1=233.236，F2=306.465；IgG3：F1=97.414，F2=293.089，均P＜0.001）；不同时间点的同组间比较，与免疫前相比，初免后4周的疫苗组血清IgG及其亚类均显著升高，在攻击后2周达更高水平，差异有统计学意义（IgG：F=306.807；IgG1：F=99.553；IgG2a：F=206.512；IgG2b：F=1 585.056；IgG3：F=468.935，均P＜0.001）。而IgE和IgA在3组的所有时间点均未检测出。

图1 疫苗免疫及PA01株攻击后小鼠血清IgG及其亚类抗体的水平变化Fig.1 Observation of sera IgG and IgG isotype distribution in mice immunied with rBb（pGEX⁃OprF⁃I）vaccine and challenged with PA01 strain

3 讨论

检测肺细菌负荷是评价疫苗保护力的关键指标。既往研究［15-16］表明，铜绿假单胞菌OprF或OprI蛋白疫苗可有效降低免疫小鼠的肺细菌负荷，增强清除Pa感染的能力。SAHA等［13］发现重组质粒pGACAG⁃OprF⁃I肌肉注射免疫的小鼠可抵抗铜绿假单胞菌D4株的鼻内攻击，其肺组织和血清中的肺细菌菌落数明显下降，存活率提高，显示出一定的保护作用。本研究显示rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻击小鼠后，肺细菌菌落数明显降低，与上述结果相似，表明该疫苗可诱导小鼠产生较好的保护力。

体液免疫是机体抵抗病原体的重要机制之一，抗体检测是评价其体液免疫的主要指标。高水平的IgG抗体在急性肺部感染大鼠模型中显示出较好的抗Pa感染的作用。LEE等［14］发现抗铜绿假单胞菌外膜蛋白IgG对其各型菌株具有交叉保护作用，并能激活吞噬细胞发挥调理吞噬作用。ZHANG等［15］将重组沙门氏菌的OprF⁃I融合蛋白疫苗以不同途径接种小鼠，初免后6周免疫小鼠血清和肺组织中的IgG抗体均升高，但口服灌胃组的抗体水平明显低于其他免疫组。本研究将rBb疫苗灌胃免疫及PA01株攻击小鼠后，初免后4周的免疫鼠血清IgG抗体较接种前和相同时间点的对照组明显升高，显著高于重组沙门氏菌诱导的抗体水平，推测Bb是一种良好的疫苗载体，能将目的蛋白有效传递到肠道免疫系统，在抗原提呈细胞和Th细胞辅助下刺激浆细胞合成和分泌抗体，通过再循环途径使血清IgG升高，激发更强烈的体液免疫应答，且口服灌胃是该载体疫苗较好的免疫途径。IgG能与Pa的抗原分子结合发挥中和作用；与中性粒细胞和巨噬细胞上的Fc受体结合，促进其吞噬病原体；通过经典途径激活补体，C3b和C4b等调理素可固定细菌，辅助IgG的调理作用；与NK细胞等杀伤细胞表面的Fc受体结合，活化的NK细胞可释放穿孔素、丝氨酸蛋白酶等细胞毒物质杀伤Pa。

IgG亚类在保护性免疫机制中具有重要作用，其中IgG2a和IgG1是Th1和Th2型免疫应答的标志性抗体。在铜绿假单胞菌慢性感染的早期，IgG亚类抗体水平显著增加。WEIMER等［16］将重组OprF⁃I融合蛋白肌肉注射免疫小鼠，血清抗体检测显示免疫小鼠可诱导高水平的IgG2a和IgG1，类似结果也出现在过往文献［20］中。本研究显示铜绿假单胞菌重组Bb（pGEX⁃OprF⁃I）疫苗免疫的小鼠在初免后4周血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3明显升高，表明其可能参与疫苗诱导的保护性免疫应答，该疫苗表达的抗原可刺激CD4+T细胞增殖分化为辅助性Th细胞，Th1和Th2细胞分泌多种细胞因子，从而促进IgG亚类的合成和分泌。与上述研究比较，由于Bb存在佐剂效应，Bb介导的融合蛋白疫苗可较单纯融合蛋白疫苗引起更为高效的保护性体液免疫应答。这些IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3亚类可激活补体、结合巨噬细胞和NK细胞表面的Fc受体，发挥调理和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，从而杀伤Pa。

记忆性B细胞可给机体提供长期且稳定的体液免疫记忆，与疫苗的免疫效果密切相关［17］。BEHROUZ等［18］将二价鞭毛蛋白滴鼻免疫小鼠，PAK或PA01株攻击后发现小鼠血清IgG及其亚类明显升高，抗Pa感染的能力增强。本研究发现rBb疫苗免疫及PA01株攻击后2周的免疫小鼠血清IgG及其亚类较初免后4周显著升高，表明该疫苗可刺激宿主产生较好的免疫记忆，当机体再次接触相同抗原时，记忆性B细胞可活化增殖并分化为浆细胞，使抗体滴度迅速升高，产生更强、更持久的体液免疫应答。

综上，OprF⁃I融合蛋白是具有良好免疫原性的疫苗分子，以Bb为载体介导的OprF⁃I融合蛋白疫苗显示出安全无毒、接种方便和产生较强保护力及体液免疫应答的优点，为Pa疫苗的研制提供新的思路。本研究的不足之处在于只观察了疫苗的免疫力和抗体水平，疫苗对小鼠的免疫保护效果还有待进一步观察，如实验动物的存活时间、组织切片以及体内细胞因子变化等，后续也将对疫苗的保护性免疫机制进行深入探讨，此外还将探索疫苗接种的最佳剂量、途径以及增强疫苗免疫效果的佐剂分子等诸多问题。