不同施钾量对马铃薯抗蚜虫能力的影响

姚岭柏，徐松鹤，郭美兰，王 菁，任 琴

(1.集宁师范学院 生命科学学院，内蒙古 乌兰察布 012000；2.集宁师范学院 乌兰察布经济作物逆境生物学重点实验室，内蒙古 乌兰察布 012000；3.鄂尔多斯市伊金霍洛旗第九幼儿园，内蒙古 鄂尔多斯 017200)

钾是植物必需的大量营养元素，在植物体内具有相对稳定的高浓度和强移动性，与马铃薯块茎形成及其抗逆反应密切相关。研究表明，钾所介导的植物防御反应与茉莉酸信号有关[1-2]，外源钾浓度的改变，通过植物体内钙等信号激活茉莉酸代谢途径加速茉莉酸类物质合成，提高植物的抗虫性，表明钾在茉莉酸信号网络中起重要作用[3]。

茉莉酸介导的十八烷酸途径在植物诱导防御反应中具有重要作用[4]。茉莉酸过量表达的拟南芥突变株中桃蚜种群存活率明显降低。用外源茉莉酸处理番茄植株，能诱导其系统防御能力增加，使蚜虫的生存受到抑制，并且导致茉莉酸诱导的基因如PIN2mRNA在番茄叶中表达量增加[5]。野生型番茄植株被蜘蛛螨取食2 d后，茉莉酸含量增加3倍[6]。白粉虱取食拟南芥后，拟南芥体内茉莉酸途径上游应答基因LOX2和OPR3也被诱导[7]。麦双尾蚜(Diuraphisnoxia)和二叉蚜(Schizaphisgraminum)取食小麦后，小麦植株中参与茉莉酸合成和其介导的防御酶如10,11-还原酶、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450等都被大量诱导[8-9]。当受到植食性昆虫危害后，植物组织通过启动茉莉酸等信号物质调节下游合成大量挥发性化学物质。如棉花受到害虫取食后，受伤部位能够释放出大量挥发性萜烯类和绿叶挥发物，进行防御反应[10-11]。茉莉酸信号调节对植物诱导抗性方面的报道较多，但施用钾肥与马铃薯诱导抗虫防御之间的关系未见报道。

马铃薯(Solanumtuberosum)是乌兰察布市主要经济作物之一，在其生长过程中，常受到桃蚜(Myzuspersicae)的危害，导致植株生长发育不良，产量和质量受到严重影响。笔者在前期的研究中发现，施钾马铃薯叶片上桃蚜数量显著降低。鉴于此，探讨不同施钾量对马铃薯叶片中茉莉酸信号及其挥发性化学物质含量的影响，为揭示钾肥增强马铃薯抗虫机制、有效开展蚜虫的生态调控提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

马铃薯品种选用克新1号(Kexin No.1)和费乌瑞它(Feiwuruita)。克新1号由黑龙江省农业科学院马铃薯研究所育成，属中晚熟高产品种。费乌瑞它原产于荷兰，属早熟高产马铃薯品种。种子均购自内蒙古乌兰察布市种子公司。

将上述种子播种于塑料盆(内径∶高=33 cm∶27 cm)中，砂∶土为1∶2 (体积比)。每盆施农家肥500 g，施前用CuSO4对农家肥消毒。每盆种植马铃薯1株，自然条件下生长。

选取长势一致、具有4片叶子的克新1号和费乌瑞它各40盆，将其分为4组，每组10盆，分别施硫酸钾0、4、6、8 g/株。其中，0 g/株为对照(CK)。自然条件下生长2个月后，随机摘取各处理叶片放入液氮罐中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 桃蚜行为选择试验 根据程丽坤等[12]方法略加修改。所用仪器为“Y”型嗅觉仪，内径3 cm，底部长臂22 cm，上部两短臂17 cm，两臂夹角75°。“Y”形管内置1根“Y”形铁丝，铁丝端部穿过纱网，每个管臂均用Teflon管与流量计连接后，其中一短臂与马铃薯植株连接，另一臂与装有蒸馏水和活性碳的玻璃瓶相连。调节两臂气流均为200 mL/min后，将准备好的蚜虫由基部释放口单头放入。每个处理观察20 min，试虫20头。重复10次。

对4、6、8 g/株处理均进行了测试，依据本研究中所测挥发物、脂氧合酶活性及茉莉酸含量的测定结果，6 g/株试验效果最佳，故选择6 g/株施钾植株数据作为最终数据界定行为选择。当蚜虫爬至超过某臂的10 cm处并持续5 min以上，记录为其对该臂的味源做出了选择。若蚜虫引入20 min后没有做出选择，则记录为无反应。每测5头后调换“Y”型管方向1次，每测完20头用75%乙醇擦洗管的内、外壁，烘干后再用。

1.2.2 马铃薯挥发物收集与测定 采用动态顶空采集法收集不同处理马铃薯挥发物。收集挥发物所用吸附管(Chrompack公司)长16 cm、内径3 mm，内装吸附剂为Tenax-GR(Sigma公司)。

采用热脱附-气相色谱-质谱联用仪(TCT-GC-MS)测定马铃薯挥发物。仪器型号分别为CP-4010 PTI/TCT(CHROMPACK公司)、TRACE TM GC 2000(CE INSTRUMENT公司)、VOYAGER MASS(FINNIGAN公司)。

TCT主要条件为，System Pressure：20 kPa；Rod temperature：250 ℃(10 min)；Trap inject：260 ℃。

GC的工作条件为，色谱柱DB-5 Low Bleed/MS柱(60 m×0.32 mm×0.5 m)，通过液氮脱附进样，He载气。GC程序升温：初始温度为40 ℃，保持3 min；以 6 ℃/min升至270 ℃，保持5 min；Post run 280 ℃，保持5 min。

MS工作条件为，Ionization Mode：EI；E-energy：70 eV；Mass range：29～350 amu；I/F：250 ℃；Src：200 ℃；Emission Current：150 μA；全扫描，每次扫描所用时间0.4 s，质谱扫描范围(m/z)19～435。

挥发性物质鉴定：采用NIST 02谱图库兼顾色谱保留时间进行马铃薯挥发物成分鉴定，并通过面积归一化法以各类挥发物的相对含量进行定量。

1.2.3 马铃薯叶片中茉莉酸提取与含量测定 样品提取：分别取不同处理的马铃薯新鲜叶片约0.5 g，加入少量抗氧化剂，用异丙醇、水、盐酸组成的提取液(2.000∶1.000∶0.002,体积比)低温研磨后转入离心管内。分别加入内标9,10-二氢茉莉酸(2 ng/μL)于上述管内，置于摇床30 min(4 ℃、100 r/min)。取出后再加二氯乙烷1 mL，再摇30 min。之后于低温离心机中离心(12 000 r/min、5 min)，得到上清液，用氮气吹干仪吹干。加50%甲醇100 μL，12 000 r/min离心10 min，取上清液，放入带插管的取样瓶后开始进样，用于高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC/MS)测定。

测定条件：采用超高效液相色谱(Agilent 1260)-质谱(ABQtrap 5500)联用仪进行茉莉酸测定。色谱柱：C18(1.8 μm，4.6 mm×50 mm)；流动相为乙腈和0.1%乙酸水，流速为0.8 mL/min。流动相初始为90%的0.1%乙酸水、10%的乙腈；5 min时为90%的乙腈和10%的0.1%乙酸水。

定性与定量分析：分析茉莉酸标准样品峰度，通过保留时间对样品进行定性。根据面积比等于浓度比的关系，求出该物质含量。

1.2.4 马铃薯叶片LOX活性及蛋白质表达量测定 粗酶液制备：分别取不同处理马铃薯叶片0.1～0.2 g，加入预冷的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(含7%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨，加入3～5粒铜试剂，定容至4 mL。匀浆液于4 ℃、5 000 r/min离心20 min，上清液即为酶液。

LOX活性测定：采用比色法进行测定。所用仪器为UNIC紫外可见分光光度计(UV-2800)。取上述不同粗酶液60 μL(对照管加60 μL磷酸钾缓冲液)，加入2 940 μL底物(0.126 mL的亚油酸用3 mL乙醇溶解，再溶于0.2 mol/L Tris缓冲液中，摇匀即可)，234 nm条件下比色，记录OD值。

LOX蛋白表达量：参考马晓林等[13]的方法，通过iTRAQ技术研究不同钾肥处理对LOX蛋白表达量的影响。(1)蛋白质的提取与消化：取植物叶片，加入TCA-冰丙酮冰浴研磨，-20 ℃沉淀2 h，4 ℃、30 000×g离心30 min。取沉淀，再加入预冷的纯丙酮清洗沉淀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃、20 000 g离心30 min。取部分沉淀加入1.5 mL离心管中(加0.1～0.5 mL即可)，加入配制好的SDS复溶Buffer，超声5 min助溶，离心25 min，取上清100 μL，加入DTT至终浓度10 mmol/L。56 ℃水浴1 h。迅速加入IAM至终浓度55 mmol/L，暗室静置1 h。加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，-20 ℃沉淀3 h。4 ℃、20 000×g离心20 min，取沉淀。加入50 μL的1% SDS复溶沉淀，用水稀释至250 μL，超声3 min助溶。使用2D-Quant Kit定量，SDS-PAGE检测蛋白质质量与定量准确性。每个样品取100 μg，加入与100 μg样品等体积的纯TEAB，用含0.1% SDS的TEAB补齐所有样品体积。加入1 μg/μL的Trypsin，每100 μg蛋白质底物加入3.3 μg的酶，37 ℃水浴24 h，补加Trypsin 1 μg。37 ℃水浴12 h。冻干消化液，然后每管使用50 μL TEAB(水∶TEAB=1∶1，体积比，含0.1% SDS)复溶肽段。取1 μL消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率。(2)iTRAQ试剂标记肽段：将标记试剂平衡至室温。每管标记试剂中加入70 μL异丙醇，混匀，离心甩至管底。将混好的标记试剂加入到肽段中，混匀后甩至管底，室温静置2 h。MALDI检测标记效率(用MS/MS检测是否有标记基团脱落)。(3)micro-Tof-Q检测肽段信号：将标记样品稀释后调pH值至3.0，用0.22 μm有机膜过滤。经排气、清洗、平衡至压力后，即可在HPLC(强阳离子交换色谱)中上样。收集样品，通过C18反相色谱除盐。合并MALDI图谱类似的肽段，低温离心抽干。20 μL 0.1%甲酸复溶。取0.8 μL样品点靶，LC-MS/MS分析。(4)Western blotting：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，室温转膜(100 V，90 min)。10%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加一抗(北京华大蛋白质研发中心有限公司制备)，37 ℃ 1 h，TBST漂洗3次，每次10 min；加二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，购于Jackson公司)，37 ℃ 40 min，TBST漂洗3次，每次10 min。AB(发光液)液混合后，滴入膜上显影，BIORAD凝胶成像仪拍照、保存。

1.3 数据处理

试验数据用统计软件SPSS 18.0进行分析。各处理中的重复数据通过单因素方差进行分析，并用LSD法进行处理间差异显著性检验(α=0.05)。选择性试验数据采用多配对样本的Cochran’sQ检验法进行分析。

2 结果与分析

2.1 桃蚜对马铃薯植株挥发物的行为反应

桃蚜对马铃薯2个品种选择行为反应不同，其中对费乌瑞它施钾植株的趋向率为 26%，对其对照植株的趋向率为71%；对克新1号施钾植株的趋向率为30%，对其对照植株的趋向率为64%。方差分析结果显示，与各自的对照相比，桃蚜对施钾马铃薯2个品种的趋向反应均有显著差异，表明施钾马铃薯植株对桃蚜具有明显的趋避性。

2.2 不同处理马铃薯挥发物含量变化

桃蚜对马铃薯植株的趋性行为反应与植株中挥发物种类和含量密切相关。施钾后，克新1号马铃薯植株挥发物含量变化最明显的有4种：3-蒈烯、苯甲醛、柠檬烯和1，3-环己二烯。由图1A可知，分别与各自的对照相比，3-蒈烯含量在施钾6 g/株时显著升高。施钾8 g/株时，虽然3-蒈烯含量也升高，但方差分析结果显示，与对照差异不显著。不同施钾量均使马铃薯植株中苯甲醛含量升高，但只有6 g/株施钾量时苯甲醛含量显著高于对照。施钾处理时柠檬烯含量均显著高于对照，其中6 g/株施钾量时柠檬烯含量达到最高，是对照的2.5倍。费乌瑞它植株施钾后挥发物的变化与克新1号不同，3种挥发物中，只有苯甲醛含量在施钾6 g/株和8 g/株时显著高于对照，其余2种挥发物与对照差异不显著(图1B)。就1,3-环己二烯含量变化来说，施钾量分别为6、8 g/株时，该挥发物含量在克新1号植株中显著增加，而费乌瑞它在施钾4 g/株时，1,3-环己二烯含量显著升高。综上，克新1号植株在施钾量为6 g/株时，4种挥发物的含量均显著增加。

A：克新1号；B：费乌瑞它；C：1,3-环己二烯；不同小写字母表示差异显著(PA:Kexin No.1;B:Feiwuruita;C:1,3-cyclohexadiene;Different small letters show significant difference(P图1 不同施钾量对马铃薯植株中挥发物含量的影响Fig.1 Effect of different potassium supply on the content of potato plant volatiles

2.3 不同处理克新1号叶片茉莉酸含量及关键酶活性变化

施钾处理马铃薯克新1号挥发物变化较为规律(图1)，故选用克新1号进行信号物质茉莉酸含量及关键酶活性研究，结果如图2所示。与对照相比，4 g/株施钾量均不能提高马铃薯叶片中茉莉酸含量和LOX活性(P>0.05)。6 g/株施钾量却显著提高了马铃薯叶片中茉莉酸含量和LOX活性，两者分别比对照提高了0.93、0.40倍。8 g/株施钾量尽管也使茉莉酸含量和LOX活性有所升高，但与对照无显著差异。LOX活性的变化规律与茉莉酸含量变化规律一致，说明不同处理中6 g/株施钾量对马铃薯克新1号叶片茉莉酸含量和LOX活性影响最大。

图2 不同施钾量对克新1号叶片中茉莉酸含量及LOX活性的影响Fig.2 Effect of different potassium supply on jasmonic acid content and LOX activity of Kexin No.1 leaves

2.4 不同处理对克新1号叶片LOX蛋白表达量的影响

不同处理对LOX蛋白表达量的影响见图3，Western杂交进一步确定了LOX蛋白变化的有效性。与对照相比，4 g/株施钾量并未使马铃薯叶片LOX蛋白表达量增加，但6、8 g/株施钾量均上调了其LOX蛋白的表达量，从而使茉莉酸生成量增多，马铃薯抗性提高。

图3 不同施钾量对克新1号叶片中LOX蛋白表达影响的Western杂交分析Fig.3 Western blotting analysis of LOX protein of Kexin No.1 leaves after different potassium supply

3 结论与讨论

本试验条件下6 g/株施钾量为马铃薯抗桃蚜的最佳施钾量，此时桃蚜对施钾马铃薯趋性行为显著低于对照，马铃薯克新1号叶片中3-蒈烯、苯甲醛、柠檬烯和1,3-环己二烯 4种挥发物含量、茉莉酸含量及LOX活性均显著提高。表明钾肥能够促进茉莉酸合成，由此调节其下游挥发物含量，提高马铃薯的抗虫性。

近年来的研究表明，植物的抗虫能力与其营养密切相关[14]。适量供钾提高了小麦植株对钾的吸收，促进了植株生长和总酚、酚酸、木质素的合成及与代谢相关酶的活性，增强了小麦对蚜虫的抗性[15]。钾元素可通过提高苜蓿碳氮比，降低游离氨基酸含量，提高苜蓿对蓟马的耐害性[16]。当小麦受到蚜虫危害后，充足供钾激活了小麦体内茉莉酸信号传导途径，显著提高了茉莉酸含量，由此提高了防御酶活性，增强了小麦对蚜虫的抵御能力[17]。用磷酸钾处理小麦植株，可诱导其对俄罗斯小麦蚜虫(Diuraphisnoxia)的耐受力[18]。上述研究结果与本研究结果一致，说明外源钾的供应可能影响了植物体内茉莉酸相关基因的表达[1]。

植物的新陈代谢、生长和抗逆反应与细胞内钾含量有关。研究表明，钾介导的转录和茉莉酸相关，其也是茉莉酸合成途径中必需酶的组分[2]。本研究中，外源钾浓度的增加，能够激活植物体内茉莉酸代谢途径，使茉莉酸类物质合成加速，从而调节挥发物的生成量，对植食性昆虫起到防御作用。

养分的缺乏和过量胁迫均会影响植物的正常生长发育，引起一些生理生化过程的改变，这些改变可以引起大量蛋白质种类和表达量发生变化。ZHANG等[7]研究了玉米对亚洲玉米螟的茉莉酸甲酯诱导防御反应，确定了62种与茉莉酸甲酯诱导相关的蛋白质，其中43种蛋白质含量增加，11种蛋白质含量降低，表明茉莉酸甲酯不仅能够诱导植物对昆虫的防御机制，而且也促进了植物体内有毒蛋白质的产生，以此对亚洲玉米螟进行生物防治。本研究只对茉莉酸合成中的关键性酶(LOX)进行了一些研究，其他相关蛋白质与施钾的关系有待于进一步探讨。