褪黑素对雄性动物生殖机能影响的研究进展

2020-12-22申艳超张子敬杨国峰张士坤王二耀王迎港黄永震王献伟白献晓徐照学王三虎

河南农业科学 2020年3期

申艳超,张子敬，杨国峰，张士坤，王二耀，王迎港，黄永震，王献伟，白献晓，徐照学，王三虎，张伟

(1.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；3.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100；4.河南省畜牧总站，河南郑州 450008)

褪黑素(Melatonin，MT)，又称为抑黑素、松果腺素，1958年从牛的松果腺中提取出来。褪黑素广泛参与机体的众多生理过程，具有重要的生物学功能，与节律性调节、免疫调节、肿瘤发生、神经内分泌调节、清除自由基、抗氧化和延缓衰老等有密切关系[1]。目前许多研究已证实，MT在雄性动物生殖过程中具有广泛作用，可提高精子顶体完整率、质膜完整率和线粒体活性，抑制精子凋亡，从而改善精液品质[2]。鉴于此，综述了近年来国内外有关褪黑素在雄性动物生殖系统中的分布、作用研究进展，以期为褪黑素在雄性动物生产中更广泛的运用提供参考。

1 褪黑素概述

1.1 褪黑素的分子结构

褪黑素的化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，是色氨酸的衍生物；分子式为C13N2H16O2，相对分子质量为232.28，熔点116～118 ℃[3-4]。在动物体内，褪黑素主要是由松果腺合成和分泌的神经内分泌激素，具有高度亲脂性和部分亲水性，具有高度弥散穿透能力，可弥散穿透各种生理屏障，高效清除细胞内自由基以及在细胞膜、细胞浆和细胞核中发挥强有力的抗氧化作用[1-2]。

1.2 褪黑素在雄性动物生殖系统的分布

脊椎动物的松果体、视网膜、皮肤、血液、胃肠道等均可合成褪黑素[5]。此外许多研究证实，褪黑素在诸如小鼠、大鼠、牛、山羊、绵羊、鹿、骆驼、禽类等多种雄性动物生殖系统中广泛表达[6-7]。同一物种不同个体及不同物种体内的褪黑素分泌量与季节和光照因素密切联系，具有明显的昼夜节律性变化。夜间褪黑素的分泌量明显高于白天，短日照明显高于长日照。不同个体之间夜间褪黑素分泌量差别很大，不同物种间分泌量也不同[8]。同一物种不同品种之间也具有差别，如采用放射免疫分析法(RIA)测定济宁青山羊(高繁殖力)和沂蒙黑山羊(低繁殖力)不同季节血浆中褪黑素分泌变化规律，发现除冬季外的其他季节，济宁青山羊在各个采样点的褪黑素浓度均高于沂蒙黑山羊，并且夜间褪黑素的平均分泌量均极显著高于沂蒙黑山羊[9]。季节性发情动物血液中的褪黑素浓度变化与季节有关，亚热带气候条件下饲养的季节性繁殖动物雄鹿，繁殖过程中不同季节睾丸中精子运动能力、精子密度、精子质膜完整率等质量指标有显著的差异，而且血液中褪黑素浓度有明显的季节性差异，揭示环境温度-湿度指数(THI)对雄性动物体内褪黑素的浓度及生殖功能具有重要影响[10]。

1.3 褪黑素的合成代谢

在动物体内，色氨酸在酶的催化作用下合成褪黑素：松果腺细胞摄入色氨酸后，松果体在光神经的控制下，经过色氨酸羟化酶的作用生成 5-羟色氨酸；5-羟色氨酸在芳香 L-氨基酸脱羧酶作用下脱羧形成5-羟色胺；5-羟色胺再经N-乙酰、羟吲哚一氧甲基转移酶的催化生成5-甲氧基-N-乙酰色胺，即合成褪黑素。芳烷基胺-N-乙酰基转移酶(AA-NAT)活性决定着褪黑素的合成和分泌节律，是褪黑素生物合成的关键酶之一，使5-羟色胺转变成乙酰羟色胺[6]。不同物种AA-NAT基因同源性很高，人类AA-NAT基因全长2.5 kb，位于染色体17q25处，有4个外显子。其中，外显子1未被翻译，其他3个(238、155、453 bp)可翻译成蛋白质。偶蹄类动物AA-NAT基因相似性很高，如乐至黑山羊与绵羊、普通牛同源性分别为97.6%和95.51%，而且AA-NAT基因的多态性与雄性动物繁殖具有相关性[6，11-12]。褪黑素在机体中经典的降解途径是在肝脏中，通过细胞色素P450酶亚型的6-羟基化产生6-羟基褪黑素，催化褪黑素中的氧去甲基化形成N-乙酰-血清素(N-乙酰-5-羟色胺)，然后被硫酸化或葡萄糖醛酸化，其产物通过尿液排泄出来。此外，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、辣根过氧化物酶等将褪黑素转化为N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬脲酰胺(AFMK)。AFMK进一步通过芳胺甲酰胺酶或过氧化氢酶作用转化为N1-乙酰基-5-甲氧基氨基脲(AMK)[13]。

1.4 褪黑素的作用机制和特点

褪黑素发挥生物学作用依赖于其特异性受体，褪黑素受体均为膜表面受体，分别为褪黑素膜受体1(Melatonin receptor 1,MT1)和褪黑素膜受体2(Melatonin receptor 2,MT2)等膜表面受体，以及位于核内的视网膜酸受体相关孤儿受体α(Retinoid related orphan nuclear hormone receptor,RORα)[7]。上述3种受体在多种家畜和家禽的神经系统(如大脑、下丘脑、中脑、嗅球和视交叉等脑区)和周边组织(如心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠、胸腺、肌肉等组织)广泛表达[14-15]。在雄性动物生殖系统的各种组织器官，如睾丸中的精原细胞、支持细胞、间质细胞、未成熟的精子[16-18]和附睾中的附睾上皮细胞、成熟精子[6]，精囊腺和输精管中等也广泛分布[19]。褪黑素对机体的作用具有低毒性、无依赖性、内源性和小剂量等特点[5]，但褪黑素的生物学功能与其表达量及所在组织的生理功能密切相关[20]。3月龄山羊睾丸中MT1和MT2主要分布在原始生殖细胞和睾丸间质细胞中并且高表达，RORα在支持细胞和原始生殖细胞中低表达，并且仅在间质细胞的核周区高表达。进一步分析3月龄与10月龄的山羊睾丸，MT1和MT2表达量随着年龄增加而减少，RORα的mRNA表达则相反呈现增加趋势[21]。MT1全长350个氨基酸，MT2全长363个氨基酸，与MT1有60%的同源性，MT1和MT2通过与G蛋白偶联参与下游信号转导[22]。依据细胞种类和生理功能的不同，MT1可以进一步活化增加蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、C-Jun肠溶激酶(C-JNK)。MT2则可以抑制cAMP和JNK[6，23]。RORα包括3个亚型(A、B、C)和A亚型的4个接头类型，这些核受体通过依赖性转录因子在动物生殖细胞增殖、分化过程中发挥重要作用[7]。

2 褪黑素多方面影响雄性动物的生殖机能

2.1 雄性生殖器官发育

褪黑素作用于下丘脑-垂体-性腺轴来实现对雄性动物生殖机能的调控作用。光照是影响褪黑素产量的主要环境因子，在自然条件下，随季节变化而发生的昼长变化，是启动繁殖周期的重要因子[24]。尤其是对于季节性繁殖动物，利用人工光照改变动物体内褪黑素的分泌进而促使某些哺乳动物的繁殖季节提前，如对乏情动物在秋冬季补充光照，或全部进行人工“全日照”模拟夏季光周期[25]。有研究报道指出，褪黑素处理可以使公羊初情期提前，而乏情公羊必须经受一段时间的长日照后，皮下埋植褪黑素才能引起睾丸重新发育[26]。当雄性动物进入老年期后，睾丸中凋亡细胞增多，质量下降，但是采用褪黑素处理衰老期雄性大鼠后，睾丸质量下降缓慢，睾丸分泌睾酮水平显著升高[27]。生殖器官发育不良的雄性动物采用褪黑素腹腔注射治疗后与正常雄性动物相比，其睾丸发育包括睾丸质量、睾丸指数无显著差异，进一步检测不同处理组精子的密度、精子顶体完整率和精子质膜完整率，均无显著差异[28]。此外，褪黑素作为一种亲脂性、易通过细胞膜的亲水性化合物，在睾丸发育中也是一种有效的抗氧化剂，有助于睾丸癌症治疗、免受环境的氧化损伤和其他有毒分子的副作用[27]。综上，褪黑素对雄性生殖器官发育特别是受到环境氧化应激损伤时，具有良好的保护作用，有利于畜牧生产。

2.2 精子发生

精子发生是一个有序复杂的细胞分化过程，精原细胞分化为原始精母细胞，最后形成初级精母细胞。褪黑素和褪黑素受体在精子发生的各级细胞中普遍存在，在动物受精阶段褪黑素及其受体的表达水平最高，具有直接调节精子功能的生理作用[29]。将发情期前小鼠睾丸暴露于双酚A(BPA)或邻苯二甲酸二己酯(DEHP)中，会损害精子发生，并干扰精原细胞的活性和减数分裂。当采用褪黑素处理后，通过维持睾丸中精原干细胞和减数分裂细胞正常的H3K9二甲基化从而保护睾丸免受上述2种内分泌干扰物的影响[30]。有研究发现，在山羊睾丸精原干细胞体外分化系统中，加入10-7mol/L褪黑素可增加其核内受体RORα的表达，并显著提高单倍体细胞的分化和形成精子的效率。但采用RORα激动剂(CGP52608)处理后，可显著提高睾酮浓度和GATA结合因子4(GATA-4)的表达。揭示褪黑素及其受体在雄性动物精子发生过程中和精原干细胞的分化培养中起到关键作用[21]。

2.3 精子质量与运动

褪黑素能清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，且能激活多种抗氧化系统，对精子膜的脂质过氧化损伤有保护作用，延长精子存活时间，提高冻后精子质量[31]。精子线粒体是提供精子运动的能量源泉，其结构与功能的改变，必然影响到精子的运动能力[32]。体外精子热处理试验表明，与正常处理组相比，培养液中含有褪黑素组精子的存活率和直线运动的比例显著增加。褪黑素的强抗氧化能力，具有保护精子线粒体对抗ROS 攻击的作用，从而增加线粒体的活性[33]。氧化应激会导致精子DNA损伤，进而导致其受精能力下降。另外，采用1 mmol/L褪黑素预培养后的精子与未处理精子相比，细胞运动能力增强，并使精子细胞中的DNA致密化，防止正常精子中的DNA断裂[34]。也有报道指出，采集非繁殖季节经不同浓度褪黑素处理公绵羊精液，与繁殖季节时采集到的精液相比，精子的运动能力、存活率等没有显著差异[35]。在非繁殖季节，当采用褪黑素皮下植入处理摩拉水牛后，精子直线运动的比例、精子活力显著升高，精子异常运动率显著下降。此外，精浆总蛋白、白蛋白及胆固醇含量显著增加，而天冬氨酸转氨酶活性降低，成功提高了热带气候下水牛非繁殖期的精液质量[36]。

2.4 精子超活化和受精作用

精子在雌性生殖道或合适的条件下完成获能才能顺利受精，在获能的最后阶段，精子运动时头部呈“8”字形运动，称为精子超活化，并产生推进力促进精子穿越透明带[35]。目前有研究报道，添加褪黑素处理仓鼠精子后，精子超活化能力显著增强，而且褪黑素通过其受体MT1影响精子细胞内Ca2+和NO发生作用[37]。进一步研究则证实，褪黑素通过抑制eNOS活性，减少NO产生，进而消除自由基引发的损伤，从而影响精子的超活化[38]。但是褪黑素增强精子超活化的作用可以被17β-雌二醇通过雌激素受体(ER)的非基因组调节抑制[39]。在非繁殖季节，采用褪黑素处理公绵羊后，采集其精液，与繁殖季节相比，精子的运动能力、存活率等没有显著差异；并且发现100 pmol/L褪黑素处理后的精子在体外受精后，卵母细胞受精率、受精卵卵裂率则显著增加[35]。在非繁殖季节，当成年公羊采用皮下植入褪黑素处理90 d后，与对照组相比，褪黑素处理组显著提高了公羊精清中谷氨酸、乙酰肉碱、胆碱和精氨酸浓度，而且进一步检测处理组精子的体外受精能力，发现其形成囊胚数显著增加，受精能力增强[40]。

2.5 精液品质与保存

褪黑素一方面可提高精子顶体完整率、发育能力和线粒体活性，抑制精子凋亡；另一方面，褪黑素可以提高雄性动物精清中谷氨酸、乙酰肉碱、胆碱和精氨酸等有利于精子保存的物质浓度,从而改善精液品质。目前在小鼠、大鼠[41]、牛[2]、绵羊[42]、山羊[21]、雄鹿[43]等多种动物中均有报道，添加适宜浓度褪黑素能够抑制精液保存中精子细胞的氧化性损伤，显著提高精液保存质量。在实际生产中，褪黑素作为抗氧化剂已广泛运用于动物精液体外保存，如猪、羊精液的低温保存[44]。

2.6 雄性生殖内分泌

松果腺分泌的褪黑素可以与垂体或下丘脑上的受体结合，调节下丘脑激素的分泌，进而作用于性腺，实现对下丘脑-垂体-性腺轴的调控，引起生殖激素的分泌发生变化。在某些物种中(如绵羊)，褪黑素通过改变促性腺激素释放激素(GnRH)诱导的卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)的分泌来间接影响血液中睾酮的浓度。对绵羊进行MT处理，第7天血浆中孕酮含量与处理前差别达到极显著水平，第10天血浆中孕酮含量差别达到显著水平，说明褪黑素对孕酮的分泌有促进作用[42，45]。

雄激素主要由睾丸间质细胞分泌，肾上腺皮质、卵巢和胚胎也可分泌少量雄激素。雄激素种类繁多，在动物体内主要以睾酮为主[46]。在小鼠睾丸间质细胞系中，褪黑素通过下调GATA-4表达进而作用于类固醇合成快速调节蛋白从而抑制睾酮分泌[47]。在山羊精原干细胞体外分化培养系统中，褪黑素通过其核内受体RORα增强GATA-4的表达促进睾酮的生成[21]。褪黑素还能促进共培养绵羊睾丸间质细胞和支持细胞睾酮的分泌，增加干细胞因子表达，并通过MT1促进胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达，减少了支持细胞中的雌激素合成[48]。此外，褪黑素可以促进绵羊雄性激素受体的表达以及雄激素的分泌[46]，在睾丸间质细胞中，褪黑素通过启动子区域抑制芳香化酶基因表达，从而抑制芳香化酶的活性和抑制雌激素生物合成，但具体的机制需要深入研究[49]。

2.7 雄性生殖疾病治疗

雄性动物常见生殖疾病主要有隐睾症、睾丸扭转、睾丸炎、附睾炎、阴囊炎、精囊腺炎等，导致生精机能障碍、精液品质不良、受精障碍等，影响畜牧业生产。目前有关褪黑素与雄性动物生殖疾病关系的报道较少，隐睾症指由于各种不确切病因一侧或双侧睾丸未能从腹膜后下降至同侧阴囊内。有研究报道指出，在大鼠隐睾(单侧或双侧)模型中，无论单侧或双侧隐睾大鼠与正常大鼠相比，其睾丸质量显著下降。对单侧(双侧)隐睾大鼠注射0.7 mg/kg剂量的褪黑素后，与未处理单侧(双侧)隐睾大鼠相比，其睾丸质量显著增加，精子密度、精子运动能力显著增强，说明褪黑素处理具有缓和动物隐睾危害的作用[50]。褪黑素(20、50、100 mg/kg)处理缺血性睾丸扭转大鼠后，与睾丸扭转组相比，透射电镜观察扭转组睾丸中有大量空泡和残留细胞器退化产生的颗粒，精原细胞胞浆中的局部空隙等损伤病理，而褪黑激素处理后，特别是剂量为100 mg/kg的处理，睾丸病理损伤状态显著减轻，说明褪黑素可以用来预防睾丸扭转过程中的缺血或再灌注损伤[41]。褪黑素调节多种生理功能，对免疫系统有多效性作用，具有抗炎特性[51]。