牛SLC13家族基因编码蛋白的生物信息学分析

黄明捷,张 勇,陈 祥,陈 伟,莫先艇,郭 勇,王天松

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

柠檬酸循环的中间体如柠檬酸盐、琥珀酸盐和α-酮戊二酸盐等是重要的能源和生物合成前体，同时还具有信号传导作用，如柠檬酸盐能作为大脑中用于感知能量和营养物的调节信号[1]。柠檬酸循环中间体从质膜转运到细胞中是通过溶质载体13(Solute carrier 13，SLC13)家族转运蛋白介导。SLC13蛋白家族是在原核生物和真核生物中均被发现的超级转运蛋白家族[2]，它属于SLC家族中的一个亚族，对调节动物机体组织、血浆以及尿液中代谢物含量极其重要。脊椎动物SLC13家族由5个基因构成，根据其作用底物的特性可分为Na-羧酸盐协同转运蛋白(Na+-carboxylate cotransporters，NaC)和Na-硫酸盐协同转运蛋白(Na+-sulfate cotransporters，NaS)[3]。NaC包括SLC13A2、SLC13A3和SLC13A5蛋白，它们在肾皮质、小肠、肝脏、大肠有一定分布[4-6]。SLC13A2基因敲除小鼠会表现出肾脏再吸收缺陷[7]，NaC参与柠檬酸循环中间体的介导转运，还可以直接影响代谢酶。NaS包括SLC13A1和SLC13A4蛋白，SLC13A1蛋白存在于肾脏近端小管和肠上皮细胞[8]，SLC13A4蛋白存在于胎盘和睾丸中[9]。NaS介导转运阴离子如硫酸盐、硒酸盐和硫代硫酸盐，它对维持机体硫酸盐稳态具有重要意义[10]，SLC13A1基因敲除小鼠表现出硫酸盐血症，其生长迟缓、生育能力降低[11]。

鉴于SLC13蛋白家族具有调节机体柠檬酸循环中间体以及代谢物稳态的功能，其对牛生长发育状况以及代谢疾病的产生有不可忽视的作用，但目前关于牛SLC13蛋白的生物信息学方面的研究尚未见报道。为此，应用生物信息学方法分析牛SLC13蛋白，初步探究其理化性质、疏水性、二级结构及三级结构、保守基序、亚细胞定位、跨膜区、蛋白质互作情况和系统进化，以期为揭示牛SLC13蛋白的生物学功能、提高牛生长性能和代谢疾病防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 序列来源

本研究所用数据均来源于NCBI数据库，各物种SLC13蛋白信息见表1。

表1 各物种SLC13蛋白信息Tab.1 Information of SLC13 protein of each species

1.2 生物信息学分析

通过在线软件ExPASy中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)分析牛SLC13基因家族蛋白的氨基酸序列组成和理化性质；应用Pepwheel(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel)和ProtScale(https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)，构建蛋白质的螺旋轮，并分析氨基酸残基的亲疏水性；通过在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)预测牛SLC13家族蛋白的二级结构及三级结构；利用CSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)绘制蛋白质结构图，使用MEME(http://meme-suite.org/index.html)对牛SLC13蛋白序列基序进行分析；利用在线软件PsortⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)对牛SLC13蛋白的亚细胞定位进行预测；利用TMHMM Server.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)进行跨膜区分析；应用STRING(https://string-db.org)分析SLC13蛋白的互作网络；利用MEGA 6.05软件中的最大似然法(Maximum likelihood，ML)构建各物种间SLC13蛋白的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 牛SLC13蛋白理化性质分析

使用在线软件ExPASy中的ProtParam分析牛SLC13蛋白的氨基酸序列组成和理化性质，结果见表2。从表2和图1可以看出，牛SLC13基因家族成员编码的氨基酸数目在520～626个，氨基酸组分中亮氨酸(Leu)含量最高，组氨酸含量最低(His)；SLC13蛋白氨基酸分子质量从57.80～68.96 ku不等，等电点介于7.01～8.67，亲水性总平均值(Grand average of hydropathicity，GRAVY)均大于0；SLC13A2为不稳定蛋白，SLC13A1、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5均为稳定蛋白(不稳定系数小于40，为稳定蛋白)[12-13]。

表2 牛SLC13蛋白理化性质分析Tab.2 Physicochemical properties of bovine SLC13 protein

图1 牛SLC13蛋白的氨基酸组成Fig.1 Amino acid content of bovine SLC13 protein

2.2 牛SLC13蛋白疏水性分析

构成蛋白质的多聚氨基酸能组成复杂的结构并产生特定功能，这些氨基酸总体的疏水性起着重要作用。构成蛋白质的多肽链中亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的比例，表明该蛋白质的亲水或疏水性[14-15]。利用Pepwheel构建牛SLC13蛋白的螺旋轮(图2)，以识别疏水性和亲水性残基的分布情况，脂肪族残基用正方形标记，亲水性残基用菱形标记，带正电荷的残基用八边形标记。应用ProtScale对牛SLC13蛋白进行预测分析(表3、图3)，根据亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的比例可知，牛SLC13蛋白均为疏水性蛋白，与ProtParam预测结果一致。

图2 牛SLC13蛋白的螺旋轮Fig.2 Spiral wheel of bovine SLC13 protein

表3 牛SLC13蛋白疏水性分析Tab.3 Hydrophobicity analysis of bovine SLC13 protein

注：亲/疏水性氨基酸值小于1，表示多肽链亲水性总氨基酸数小于疏水性总氨基酸数,则为疏水性蛋白。
Note:The pro-/hydrophobic amino acid value is less than 1,indicating that the total hydrophilic amino acid number of the polypeptide chain is less than the total number of hydrophobic amino acids,and the protein is a hydrophobic protein.

图3 牛SLC13蛋白亲水性/疏水性预测结果Fig.3 Prediction results of hydrophilicity/hydrophobicity of bovine SLC13 protein

2.3 牛SLC13蛋白二级结构和三级结构

通过SOPMA在线软件预测牛SLC13蛋白的二级结构，构成不同SLC13蛋白二级结构的α-螺旋、伸展链、β-转角以及无规卷曲均由数量相近的氨基酸组成(表4)。应用SWISS-MODEL在线软件预测牛SLC13蛋白的三级结构(图4)，发现牛SLC13蛋白有较多α-螺旋结构富集域，以β-转角和无规卷曲连接形成其特定结构。

表4 牛SLC13蛋白二级结构组成Tab.4 Secondary structure of bovine SLC13 protein

图4 牛SLC13蛋白三级结构预测Fig.4 Tertiary structure prediction of boivine SLC13 protein

2.4 牛SLC13蛋白结构和基序预测

利用CSDS绘制蛋白质结构图，并使用MEME(参数：Motif最大值为10)对牛SLC13蛋白序列保守基序进行分析(图5)。SLC13A2、SLC13A3和SLC13A5基因均有5′UTR和3′UTR，SLC13A1和SLC13A4基因仅有3′UTR，牛SLC13基因家族均含有11段以上的外显子；除SLC13A3蛋白无Motif 10、SLC13A5蛋白无Motif 8外，SLC13A1、SLC13A2、SLC13A4蛋白均存在Motif 1—10。

图5 牛SLC13基因家族的系统进化树(A)、结构(B)及蛋白质基序分析(C)Fig.5 Phylogenetic tree(A),gene structure(B) and protein motif structure(C) of bovine SLC13 gene family

2.5 牛SLC13蛋白亚细胞定位分析

蛋白质只有处于特定亚细胞区间才能发挥其功能，利用在线软件预测蛋白质亚细胞区间位置，可以了解蛋白质的功能和性质、认识蛋白质间的相互作用[16]。使用在线软件Psort Ⅱ 对牛SLC13基因家族编码蛋白进行预测分析(表5)，发现牛SLC13蛋白在细胞内主要分布在质膜、内质网和线粒体，仅有SLC13A3蛋白在高尔基体中有一定分布。

表5 牛SLC13蛋白的亚细胞定位 Tab.5 Subcellular localization of bovine SLC13 protein %

2.6 牛SLC13蛋白跨膜区分析

镶嵌在生物膜上蛋白质的功能和性质决定其生物膜的绝大部分功效，膜蛋白是在各种细胞中普遍存在并具有独特结构的蛋白质，对维持生命活动有极其重要的作用。使用在线软件TMHMM Server.2.0对牛SLC13蛋白进行跨膜区分析(图6)可知，牛SLC13蛋白均为多次跨膜螺旋的内在膜蛋白(Integral protein)。构成跨膜区蛋白的氨基酸大部分是疏水性氨基酸，与牛SLC13蛋白的疏水性区域分析结果基本一致。

图6 牛SLC13蛋白跨膜区域预测Fig.6 Transmembrane region analysis of bovine SLC13 protein

2.7 牛SLC13蛋白的互作网络

利用STRING构建牛SLC13蛋白的互作网络并进行GO功能注释。选择15个直接或间接互作节点、25条互作关系构建牛SLC13蛋白的互作网络(图7)。牛SLC13蛋白GO通路富集结果显示，其在生物学层面上主要参与羧酸跨膜运输(Carboxylic acid transmembrane transport)；在分子功能层面主要富集于羧酸跨膜转运蛋白活性(Carboxylic acid transmembrane transporter activity)和次级活性跨膜转运蛋白活性(Secondary active transmembrane transporter activity)。

图7 牛SLC13蛋白互作网络Fig.7 Interaction network of bovine SLC13 protein

2.8 SLC13蛋白的系统发育分析

用MEGA 6.05软件对14个物种的SLC13氨基酸序列共计69条进行分析，采用最大似然法比对后构建进化树，结果如图8所示。14个物种的SLC13A1蛋白与SLC13A4蛋白处于同一个较大分支，SLC13A2、SLC13A3和SLC13A5蛋白处于另一个较大分支，SLC13A2、SLC13A3、SLC13A5分支中SLC13A2和SLC13A5在14个物种中的进化上亲缘关系较近。普通牛均与瘤牛、水牛、牦牛聚为一类，具有较高的同源性，与鸡的距离最远。

3 结论与讨论

在人和小鼠中，硫酸盐在回肠中被吸收，然后通过肾脏维持其稳态。妊娠期母体对高循环硫酸盐水平的生理需求在物种间是保守的[17]，SLC13A1蛋白能维持母体正常血浆硫酸盐生理水平，而SLC13A4蛋白能将胎盘外的硫酸盐转运供给胎儿，并且SLC13A1和SLC13A4敲除小鼠会表现蛋白的出妊娠中晚期胎儿死亡现象[18-19]。因而，SLC13A1和SLC13A4的正常表达对胎儿发育至关重要。柠檬酸盐是钙的重要螯合剂，SLC13A2蛋白能调节尿液中柠檬酸盐的浓度，而许多肾结石患者表现出低柠檬酸盐，这表明SLC13A2蛋白与肾结石的发生有关[20]。SLC13A5蛋白抑制肝脏细胞外柠檬酸盐摄取，被认为是治疗代谢性疾病一种方法[21-22]。柠檬酸盐作为一种关键的调节代谢中间体，对整合糖酵解和脂质合成过程极其重要，利用SLC13A5特异性抑制剂可以减少进入肝脏的柠檬酸盐流量，进而治疗代谢紊乱[23]。

图8 不同物种SLC13蛋白系统发育树Fig.8 SLC13 protein phylogenetic tree of different species

本研究利用生物信息学技术对牛SLC13家族蛋白的理化性质、疏水性、二级结构及三级结构、保守基序、亚细胞定位、跨膜区、互作网络以及进化关系进行预测和分析，结果表明：牛SLC13基因家族编码的氨基酸数介于520～626个，亮氨酸含量最高，组氨酸含量最低，分子质量介于57.80～68.96 ku，除SLC13A2外的4个蛋白质均为稳定蛋白，其编码蛋白均为疏水性蛋白；牛SLC13蛋白的二级结构主要由α-螺旋、β-转角以及无规卷曲组成。组成蛋白质的氨基酸的数量和性质、蛋白质二级以及更高级结构决定其特性和功能，通过对蛋白质理化性质、二级和三级结构进行预测分析利于对其结构功能有更深了解[24]。柠檬酸钠能有效抑制内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)[25]，持续而强烈的ERS对内质网稳态(Endoplasmic reticulum homoeostasis)有害，会导致细胞凋亡[26]。牛SLC13蛋白能调控柠檬酸盐水平，该蛋白质亚细胞定位于内质网。可见，牛SLC13蛋白对维持胞内内质网稳态、保持细胞正常生命活动具有一定作用。利用最大似然法对14个物种的SLC13蛋白进行聚类分析，发现普通牛与瘤牛、水牛、牦牛亲缘关系相近，与鸡亲缘关系最远。家牛属(普通牛、瘤牛)、牦牛属和水牛属与野猪亲缘关系相对较近，这与王玲玉[27]的研究结果一致。NaC与NaS是作用底物特性不同的2种蛋白质，14个物种的SLC13A1、SLC13A4蛋白处于同一个较大分支，而SLC13A2、SLC13A3和SLC13A5蛋白处于另一个较大分支。由此推测，NaC和NaS有着各自的进化机制，这一现象值得进一步探究。本研究综合各种生物信息学软件，使用生物信息学方法对牛SLC13蛋白分析的理化性质、结构和生物学特性进行分析，同时对其系统进化情况展开探讨，可以为后续深入研究中SLC13基因家族参与的代谢疾病、胚胎发育等方面提供理论依据。