肾阳虚对骨关节炎大鼠软骨退变的影响

宋威江　周丽　杜梦梦　罗静　陶庆文

【摘 要】目的：探索肾阳虚对骨关节炎（osteoarthritis，OA）大鼠软骨退变的影响。方法：将18只雄性SD大鼠随机分为正常组、OA组、OA肾阳虚组，每组6只。Hulth法建立OA模型，Hulth法加腺嘌呤灌胃建立OA肾阳虚模型。通过肾阳虚症状、体征评价表评价肾阳虚证候，光镜观察大鼠膝关节软骨组织病理学改变，OARSI和Mankin's评分评价软骨退变程度。结果：OA组和OA肾阳虚组大鼠均存在肾阳虚证候表现，且肾阳虚症状、体征积分均较正常组高（P = 0.002），其中OA肾阳虚组大鼠较OA组大鼠积分更高（P = 0.004）。OA组大鼠OARSI评分为4～6分、Mankin's评分属于OA早中期;OA肾阳虚组大鼠OARSI评分为12～16分、Mankin's评分属于OA中晚期，组间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。结论：OA大鼠存在肾阳虚证候表现，且肾阳虚明显加重OA大鼠的软骨退变程度。

【关键词】 骨关节炎;肾阳虚;软骨退变;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To explore the effects of kidney yang deficiency on cartilage degeneration in osteoarthritis（OA）rats.Methods：Eighteen male SD rats were randomly divided into a normal group，an OA group and an OA kidney yang deficiency group，6 rats in each.The OA models were established by the Hulth method，and the kidney yang deficiency models were established by adenine gavage administration based on the Hulth method.The syndromes of kidney yang deficiency were evaluated by the symptom and sign evaluation table for kidney yang deficiency.The pathological changes of cartilage tissue were observed under the light microscope.The degree of cartilage degeneration was evaluated by OARSI and Mankin's scores.Results：Both of the OA group and the OA kidney yang deficiency group had the kidney yang deficiency syndrome，and the scores of kidney yang deficiency symptoms and signs was higher than those of the normal group（P = 0.002），among which the score of the OA kidney yang deficiency group was higher than that of the OA group（P = 0.004）.The OARSI scores of the rats in the OA group were from 4 to 6.Mankin's score was in the early and middle stages of OA，and the OARSI scores of the rats in the OA kidney yang deficiency group was from 12 to 16，and the Mankin's score was in the middle and late stages of OA.The difference between groups was statistically significant（P < 0.01）.Conclusion：OA rats have the symptoms of kidney yang deficiency，and kidney yang deficiency can aggravate the degree of cartilage degeneration in OA rats.

【Keywords】 osteoarthritis;kidney yang deficiency;cartilage degeneration;rats

骨關节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变为主要病理特点的慢性、进展性关节疾病，多累及负重和易磨损关节，临床以关节疼痛、功能障碍、畸形为特点[1]。据统计，我国40岁以上人群OA患病率为46.3%，70岁以上人群超过60%，严重影响国民健康[2-3]。尽管西医学飞速发展，截至目前OA仍缺乏理想的西药治疗[1]。OA属中医学“骨痹”范畴，现代中医名家普遍认为肾阳虚是本病的主要病机，并以“补肾”立法治之[4-5];临床实践和大量研究表明，温补肾阳中药治疗OA具有疗效[6-7]，但肾阳虚与OA的关系尚缺乏研究证实。本研究通过比较正常大鼠、OA大鼠、OA肾阳虚大鼠在肾阳虚证候和关节软骨退变方面的差异，探索肾阳虚对OA软骨退变的影响，以期为OA的补肾治疗提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠18只，6周龄，体质量190～210 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006。在SPF级条件下分笼饲养于北京中日友好医院临床医学研究所实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（京）2016-0043，室温20～26 ℃，相对湿度40%～60%，每日12 h光照与12 h黑夜循环，大鼠饲料和饮用水均经高压灭菌处理，定期更换垫料。

1.2 主要仪器设备与试剂 光学显微镜（上海徕卡仪器有限公司）;生物组织石蜡包埋机、病理切片机、组织脱水机、生物组织摊烤片机（樱花病理仪器株式会社）;酶标检测仪（美国Molecular Devices）;福尔马林、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、乙醇（北京九州柏林科技生物有限公司）;苏木素染液、伊红染液、乙二胺四乙酸、磷酸盐缓冲液（PBS）（北京Solabio生物科技有限公司）;腺嘌呤（SIGMA）。

2 方 法

2.1 分组与造模 适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为正常组、OA组、OA肾阳虚组，每组6只。

①Hulth法建立OA模型：OA组应用质量分数为10%的水合氯醛4 mL·kg-1腹腔麻醉大鼠，横向切开膝关节皮肤，横向切开髌韧带，再切断内侧副韧带，暴露膝关节关节腔，取下内侧半月板，再切断前后交叉韧带，逐层缝合髌韧带和关节外皮，术后3 d予青霉素腹腔注射预防感染。5周后造模成功。

②Hulth法加腺嘌呤灌胃法建立OA肾阳虚模型：OA肾阳虚组大鼠采用Hulth法造模1周后开始腺嘌呤灌胃，每只大鼠用腺嘌呤150 mg·kg-1·d-1灌胃，灌胃4周后造模成功。正常组给予等体积生理盐水灌胃。

2.2 标本采集与处理 分离各组大鼠术侧膝关节，保持关节完整性，置于体积分数为10%的中性福尔马林固定72 h后，EDTA脱钙液脱钙，每7天更换一次脱钙液，直至骨质变软时停止脱钙。常规脱水，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规脱蜡，冲洗，苏木素染色，用体积分数为1%的盐酸乙醇分化30 s，伊红染色，自来水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹胶封片。

2.3 肾阳虚证候评价 按照肾阳虚动物模型症状、体征评价表[8]进行证候评价，包括7个条目：

①毛发失去光泽;②弓背、蜷缩;③倦怠、精神萎靡;④自主活动减少;⑤反应迟钝;⑥饮食减少;⑦大便稀溏。无表现评为0分，有表现评为1分。每只大鼠每周评价1次。由2名中医师独立进行肾阳虚证候评价，意见不一致的地方通过咨询第3名中医师解决。

2.4 组织病理学评价 光镜观察各组大鼠膝关节软骨结构、细胞、基质及潮线情况。（1）根据OARSI评分对关节软骨的退变程度进行分级、分期、评分[9]。①OARSI分级：0级，浅表层完整，软骨细胞形态、排列正常;1级，浅表层水肿和（或）轻度纤维化，软骨细胞增殖、肥大;2级，浅表层连续性中断，软骨上1/3区域染色淡，过渡层深染，细胞排列紊乱、增殖、肥大、簇集;3级，过渡层和辐射层上层出现裂隙，软骨下2/3区域染色淡，新生胶原形成，软骨细胞肥大、凋亡，裂隙周围见软骨细胞簇集;4级，软骨浅表层分层、剥脱，过渡层和辐射层基质丢失、上层囊肿形成;5级，软骨下骨暴露、象牙化，可伴纤维软骨、血管翳生成;6级，软骨下骨重塑，伴纤维软骨或骨性组织修复，骨赘形成。②OARSI分期：0期，未见OA活动;1期，OA受累表面长度 < 表面总长度的10%;2期，OA受累表面长度占表面总长度的10%～<25%;3期，OA受累表面长度占表面总长度的25%～50%;4期，OA受累表面长度 > 表面总长度的50%。③OARSI评分 = 分级×分期。（2）按照Mankin's评分标准，根据软骨结构完整性、细胞数量、基质染色、潮线完整性对关节软骨退变程度进行评分并分期：0～6分为OA早期，7～9分为OA中期，10～14分为OA晚期[10]。①软骨结构：正常，0分;表面不规则，1分;血管翳形成且表面不规则，2分;裂隙达软骨过渡层，3分;裂隙达软骨辐射层，4分;裂隙达软骨钙化层，5分;完全破坏，6分。②软骨细胞：正常，0分;弥漫性细胞增加，1分;局部细胞数量增加，2分;细胞数量减少，3分。③基质染色：正常，0分;轻度减少，1分;中度减少，2分;重度减少，3分;无着色，4分。④潮线：完整，0分;不完整、有血管穿过，1分。

2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较不服从正态分布或方差不齐采用Mann-Whitney非参数检验，假设检验采用双侧检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 肾阳虚证候评价 OA造模1周后，模型大鼠的症状、体征开始出现变化。造模成功后，正常组大鼠症状、体征较造模前无明显变化，积分为0分;OA组大鼠肾阳虚症状、体征积分较正常组高，差异有统计学意义（P = 0.002）;OA肾阳虚组大鼠积分较OA组高，差异有统计学意义（P = 0.004）。见表1。

3.2 膝关节软骨组织病理 光镜下可见：①正常组大鼠膝关节软骨浅表层完整，软骨细胞形态、排列正常，基质染色均匀，潮线清晰完整;②OA组大鼠膝关节软骨浅表层连续性中断，软骨细胞增殖、肥大、簇集，部分基质淡染，潮线不完整;③OA肾阳虚组大鼠膝关节软骨浅表层大范围纤维化，纵形裂隙深入到辐射层，软骨细胞肥大、凋亡明显，基质染色淡，部分基质丢失，潮线破坏。见图1。

3.3 OARSI评分 膝关节软骨组织OARSI分级：正常组为0级，OA组为2级，OA肾阳虚组为4级。OARSI分期：正常组为0期，OA组为2～3期，OA肾阳虚组为3～4期。OA组、OA肾阳虚组OARSI评分与正常组比较，差异有统计学意义（P = 0.002或P = 0.001）;OA肾阳虚组OARSI评分较OA组更高，差异有统计学意义（P = 0.002）。见表2。

3.4 Mankin's评分 膝关节软骨组织Mankin's评分：正常组大鼠为0分;OA组大鼠为4～7分，属于OA早中期;OA肾阳虚组大鼠为7～11分，属于OA中晚期。OA组、OA肾阳虚组Mankin's评分与正常组比较，差异有统计学意义（P = 0.002）;OA肾阳虚组Mankin's评分较OA组更高，差异有统计学意义（P = 0.006）。见表3。

4 讨 论

本研究通过比较各组大鼠的膝关节软骨发现：①OA大鼠存在肾阳虚证候表现，程度较OA肾阳虚大鼠轻;②OA大鼠膝关节软骨OARSI评分较OA肾阳虚大鼠低;OA大鼠膝关节软骨Mankin's评分属早中期，而OA肾阳虚大鼠属中晚期。上述结果表明，OA大鼠存在肾阳虚的证候表现，且肾阳虚程度越重，关节软骨退变越重。

OA肾阳虚病证结合复合模型的成功构建是开展本研究的基础。理想的OA肾阳虚病证结合复合模型应具备OA组织病理学特点和中医肾阳虚的证候特点。课题组前期比较了Hulth法加去势法、Hulth法加腺嘌呤灌胃法、Hulth法加D半乳糖皮下注射法构建OA肾阳虚病证结合复合模型的差异，以Mankin's评分评价软骨组织病理学表现，从肾阳虚症状、体征和三大激素轴（甲状腺轴、性腺轴、肾上腺轴）的激素水平评价肾阳虚表现，发现Hulth法加腺嘌呤灌胃法造模后，大鼠肾阳虚和OA组织病理学表现最典型，因此，该方法是构建OA肾阳虚病证结合复合模型的最适宜方法[11]，保证了本研究结果的可靠性。

OA患病率高，可致畸和致残，西医学缺乏理想的药物治疗[1]。中医学认为，“肾主骨”“肾主生长发育”，《素问·上古天真论篇》中详细论述了人体肾气与筋骨发育的关系，随着年龄增长，肾气渐盛，筋骨渐壮，而伴随衰老，肾气渐衰，筋骨亦渐衰，说明肾阳虚伴随着筋骨衰退。流行病学调查发现，伴随衰老，OA患病率增加[3]，提示OA患者多伴有肾阳虚证候，温补肾阳可能有益于延缓OA的发生和进展。现代中医名家普遍以“补肾”立法治疗OA，如国医大师周仲瑛、全国风湿病中医专家阎小萍等[4-6]，随之形成了一系列补肾为主治疗OA的中药复方制剂，如强骨胶囊、骨痹颗粒、骨痹通方等[12-14]。课题组前期多中心随机对照临床研究发现，骨痹通方与盐酸氨基葡萄糖比较，能显著降低膝OA患者的西安大略和麦克马斯特大学评分与关节疼痛视觉模拟评分法评分，并能减少止痛药的使用[15]。然而，肾阳虚与OA的关系一直处于中医理论和名家经验阶段，缺乏研究证实，一定程度上限制了补肾中药治疗OA的推广应用。本研究从动物实验层面证明OA大鼠存在肾阳虚证候表现，且肾阳虚能显著加重OA大鼠的关节软骨退变，提示肾阳虚是OA的主要病因，可以为未来临床以“补肾”立法治疗OA及相关研究提供实验依据。

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收稿日期：2020-02-28;修回日期：2020-04-19