人参皂苷Rg3 对VEGF 诱导的RF/6A 细胞增殖与迁移能力的影响

褚文丽，陈水龄，亢泽峰，刘健，李维义，陶方方

人参皂苷Rg3（ginsenoside，Rg3）是人参生物活性和药理作用的主要药效成分之一，具有抗肿瘤、抗血管生成、提高机体免疫力等药理作用，单用Rg3即可抑制肿瘤的血管生成，和化疗药联合应用具有增效的作用，被广泛应用于肿瘤的临床治疗[1-2]。Rg3成药“参一胶囊”是经国家食品药品监督管理局批准上市的肿瘤新生血管抑制剂，适用于肺癌、胃癌、结肠癌及食道癌等多种恶性肿瘤[3-4]。大量研究显示Rg3 同样能够抑制眼部新生血管的生成，且应用及研究多集中角膜和视网膜[5-6]，仅有少量研究证实其对脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生成具有抑制作用[7]。本研究以RF/6A 细胞为研究对象，通过采用体外促血管生成因子-血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）刺激培养RF/6A 细胞，诱导其增殖，予以人参皂苷Rg3 进行干预，观察Rg3 对其增殖和移行的影响，探讨评价人参皂苷Rg3 对CNV 形成的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂DMEM 高糖培养基（美国Gibco 公司），胎牛血清FBS（美国Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（美国Gibco 公司），二甲基亚砜DMSO（美国Amresco 公司），PBS 磷酸盐缓冲液（北京索莱宝科技有限公司），青链霉素（北京源博汇科技术研究所），CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所），重组人VEGF165 蛋白（美国PEPROTECH 公司，AF100-20），0.4%台盼蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司），4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司），0.1%草酸铵结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器 5% CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific，美国），全自动酶标仪（Thermo，美国），荧光倒置显微镜（Olympus，IX81），超净工作台（西安永乐精密机械有限公司），台式高速离心机（Eppendorf，德国），4℃离心机（德国），精密电子天平（AUW220，SHIMADZU），细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司），-80℃冰箱（SANYO，日本），恒温水浴锅（AISETYLJYE-100，上海亚泰仪表有限公司）。

1.1.3 材料和药品RF/6A 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：人参皂苷Rg3（中国食品药品检定研究院，ID：F0Z7-Z25D），康柏西普眼用注射液（成都康弘药业，批号：S20130012）；Rg3 溶液配制：将Rg3 粉剂溶于DMSO，配制成终浓度为50 mmol/L 的母液，分装后于4℃保存备用。临用前用DMEM 基础培养基将母液稀释到所需浓度，DMSO 终浓度不超过0.01%。康柏西普溶液配制：临用前用DMEM 培养基将其稀释所需浓度。VEGF165 配制：将VEGF165 粉剂溶于无菌水，配置成0.1 mg/ml 母液，-20℃保存备用。临用前用10%FBS 将母液稀释到一定浓度，再用DMEM 培养基稀释到所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 RF/6A 细胞的培养 将RF/6A 细胞接种至25 cm2培养瓶中，加入5%胎牛血清的DMEM 高糖培养基常规培养，根据细胞生长情况，每3～4 d 传代1 次。取对数生长期的RF/6A 细胞进行消化、重悬、计数，用于实验。

1.2.2 CCK-8 法检测不同浓度VEGF 对RF/6A 细胞增殖的作用 取对数生长期的RF/6A 细胞，以1×105/ml密度接种于96 孔板，每孔200 μl，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，弃上清，加入基础培养基饥饿12 h 后弃培养基，分别加入20 μl 终浓度为0、10、25、50、100 ng/ml VEGF 和180 μl 完全培养基，另设空白细胞孔（只有完全培养基），每个浓度设3 个复孔，分别培养12 h、24 h、48 h 和72 h 后，每孔加入CCK-8 溶液20 μl，继续孵育4 h 后置酶标仪上，在450 nm 波长处测定每孔的吸光度值（OD 值）。

1.2.3 CCK-8 法检测不同浓度康柏西普对VEGF刺激RF/6A 细胞增殖的影响 实验方法同1.2.2，VEGF 干预浓度50 ng/ml，康柏西普干预浓度分别为0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 ug/ml，作用时间为48 h。观察不同浓度康柏西普对VEGF 诱导的RF/6A 细胞增殖的影响，选择康柏西普的最佳抑制作用浓度，用于后续实验。

1.2.4 CCK-8 法检测不同浓度Rg3 对VEGF 刺激的RF/6A 细胞增殖的影响 细胞常规接种饥饿后弃培养基，根据分组分别加入最佳刺激浓度VEGF 以及不同浓度的Rg3 和康柏西普，补足完全培养基，其分组依次为：（1）正常细胞组RF/6A 细胞正常培养；（2）VEGF 组RF/6A 细胞+VEGF；（3）康柏西普组RF/6A 细胞+VEGF+康柏西普组；（4）Rg3 低浓度组RF/6A 细胞+VEGF+Rg3 低浓度；（5）Rg3 中浓度组RF/6A 细胞+VEGF+Rg3 中浓度；（6）Rg3 高浓度组RF/6A 细胞+VEGF+Rg3 高浓度；每组设3 个复孔，分别培养48 h 后，每孔加入CCK-8 溶液20 μl，继续孵育4 h 后置酶标仪上，在450 nm 波长处测定每孔的吸光度值（OD 值）。

1.2.5 细胞划痕实验检测Rg3 及康柏西普对VEGF刺激RF/6A 细胞移行的影响 细胞以1×105/ml 密度接种到于24 孔板，每孔体系为2 ml，常规培养24 h后，弃上清，加入DMEM 高糖基础培养基，将无菌直尺放在24 孔板表面，用20 μl 微量加样枪头垂直于24 孔板，在板孔低均匀行“|”形划痕制作损伤划痕。划痕后用PBS 冲洗2～3 遍，以去除脱落悬浮的细胞，加入无DMEM 基础培养基于显微镜下拍照记录（此时为0 h）。拍照后，根据实验分组分别加入10 μl最佳刺激浓度VEGF165 及10 μl Rg3 或康柏西普，具有实验分组依次为：（1）正常细胞组：细胞正常培养；（2）VEGF 组：RF/6A 细胞+VEGF；（3）康柏西普组：RF/6A 细胞+VEGF+康柏西普组；（4）人参皂苷Rg3 组：RF/6A 细胞+VEGF+Rg3；（5）联合组：RF/6A细胞+VEGF+康柏西普+Rg3；继续孵箱培养24 h、48 h后，倒置显微镜下观察并记录各孔细胞向划痕区域迁移情况，测量划痕裸区（细胞未覆盖区）的宽度，即损伤一侧边缘到另一侧边缘的宽度，边缘的界定是以移行离开初始划行线最远而又和其他细胞相连的细胞为准。利用Image-Pro Plus 软件测量并计算迁移率。迁移率=（L0-Lt）/L0×100%（L0：起始划痕裸区宽度，Lt：各时间点划痕裸区宽度）。

1.2.6 统计学分析

运用SPSS 20.0 软件和Graphpad Prism 5.0 进行统计分析和做图，计量资料用均值±标准差表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RF/6A 细胞形态

于倒置显微镜下观察，RF/6A 细胞贴壁生长，呈扁平梭状或多角形状，大小形态较为均匀一致（图1）。细胞常规传代培养1 d 后，可见细胞80%融合，生长旺盛，继续培养3 d 后，可见细胞状态汇合至90%，排列规则，本次实验所用RF/6A 细胞为复苏后传代至第3～5 代细胞。

2.2 不同浓度VEGF 对RF/6A 细胞增殖的作用

CCK-8 法检测显示，各组OD 值比较，在12 h时间点，不同浓度VEGF 干预培养RF/6A 细胞OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。在24 h 时间点，50、100 ng/ml 组OD 值均与正常组比较有统计学意义（t=3.217，P=0.032；t=3.538，P=0.024），组间比较无统计学意义（P＞0.05），余各组与正常组比较，均无统计学意义（P＞0.05）。在48 h 时间点，比较有统计学意义（F=6.480，P=0.004），其中25、50 ng/ml 组OD 值与正常组比较有统计学意义（t=5.755，P=0.005；t=7.798，P=0.001），且50 ng/ml 组细胞增值率（1.50±0.134）明显高于25 ng/ml 组（1.14±0.104），而100 ng/ml 组与正常组比较，OD 值差异无统计学意义（P＞0.05）。在72 h时间点，各组OD 值差异无统计学意义（P＞0.05），可能和细胞培养时间较久，细胞自身的增殖有关。因此，确定50 ng/ml 作为后续VEGF 干预最佳浓度，作用时间点选为48 h（表1）。

表1 不同浓度VEGF 对RF/6A 细胞增殖的作用（OD 值，±s，n=3）

表1 不同浓度VEGF 对RF/6A 细胞增殖的作用（OD 值，±s，n=3）

注：* 与正常组比较，P＜0.05；▲与25 ng/mL 组比较，P＜0.05

2.3 不同浓度康柏西普对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用的影响

CCK-8 法检测结果显示，各组OD 值存在差异（F=13.066,P=0.000），有统计学意义。其中，VEGF 组较正常组OD 值显著增加（t=9.534，P=0.001），加入不同浓度康柏西普干预后，各组OD 值较VEGF 组均有降低（t 值依次为：-3.147,-3.709，-4.538，-10.854，-11.101，P值依次为0.035，0.021，0.011，0.000，0.000），说明康柏西普能够抑制VEGF 诱导的RF/6A细胞增殖。0.5、1.5、4.5 μg/ml 康柏西普组间比较，OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。13.5 和40.5 μg/ml 组OD 值低于正常组（P 值分别为0.04、0.00），因此，我们选择0.5 μg/ml 康柏西普作为阳性对照药物浓度用于后续实验（表2）。

表2 康柏西普对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用的影响（OD 值，±s，n=3）

表2 康柏西普对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用的影响（OD 值，±s，n=3）

注：* 与正常组比较，P＜0.05；▲与单纯VEGF 组，P＜0.05

2.4 不同浓度Rg3 对VEGF 诱导的RF/6A 细胞增殖作用的影响

VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖后，分别加入低、中、高浓度Rg3 和康柏西普，CCK-8 法检测结果显示，各组间OD 值比较存在统计学差异（F=26.546,P=0.000）。与正常组比较，VEGF 组OD 值明显增高（t=8.432，P=0.001），药物干预各组与VEGF 组比较，OD 值均有降低（t 值依次为-7.800，-4.149，-5.653，-6.952；P 值依次为0.001、0.014、0.005、0.002），其OD值从大到小依次10 μmol/L Rg3 组（0.893±0.068）、30 μmol/L Rg3 组（0.887±0.019）、90 μmol/L Rg3 组（0.827±0.022）和康柏西普组（0.756±0.041），可见，低、中、高浓度Rg3 均对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖具有抑制作用，并选择90 μmol/L 最强抑制浓度作为Rg3 作用浓度用于后续实验（表3）。

表3 人参皂苷Rg3 对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用的影响（OD 值，±s，n=3）

表3 人参皂苷Rg3 对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用的影响（OD 值，±s，n=3）

注：* 与正常组比较，P＜0.05；▲与VEGF 组比较，P＜0.05；※与30 μmol/L Rg3 组比较，P＜0.05

2.5 细胞划痕实验结果

移液枪划痕后继续培养24 h，各组细胞迁移率比较有统计学意义（F=65.891,P=0.000），其中VEGF组显著高于正常组（t=14.049，P=0.000），药物干预组低于VEGF 组（t 值依次为-9.226，-3.286，-8.329；P 值依次为0.00、0.030、0.001），联合组与康柏西普组迁移率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于Rg3 组（t=4.639，P=0.010；t=4.350，P=0.012），可见联合组和康柏西普组抑制细胞迁移力作用较强，人参皂苷组次之。划痕处理48 h，各组细胞迁移率比较有统计学意义（F=29.584,P=0.000），VEGF 组显著高于正常组（P＜0.05），药物干预组显著低于VEGF 组（P＜0.05），联合组低于康柏西普组和Rg3 组（t=8.543，P=0.001；t=3.067，P=0.037）。而康柏西普和人参皂苷Rg3 组差异无统计学意义（P＞0.05）（图2，表4）。

图2 划痕实验观察人参皂苷Rg3 对细胞迁移能力的影响（×40）。A 正常组；B VEGF 组；C VEGF+康柏西普组；D VEGF+Rg3；E VEGF+康柏西普+Rg3

表4 人参皂苷Rg3 对VEGF 诱导RF/6A 细胞移行的影响（迁移率，±s，n=3）

表4 人参皂苷Rg3 对VEGF 诱导RF/6A 细胞移行的影响（迁移率，±s，n=3）

注：* 与正常组比较，P＜0.05；▲与VEGF 组比较，P＜0.05；※ 与Rg3（24 h）组比较，P＜0.05；# 与康柏西普(24 h)组比较，P＞0.05；&与Rg3（48 h）组比较，P＜0.05

3 讨论

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）已成为我国50 岁以上人群致盲的重要病因之一[5-6]，且随着社会老龄化进程的不断加快，AMD 患病率逐年增高[7]。AMD 可分为干性和湿性两类，湿性AMD 是导致AMD 人群视力损害的主要原因。CNV 是湿性AMD 的特征性改变，是由多种因素共同作用，致视网膜色素上皮-Bruch 膜-脉络膜新生血管复合体发生病理性改变而形成。促血管生成因子和血管抑制因子平衡的破坏被认为是血管生成的关键因素，VEGF 是目前发现促新生血管形成功能最强因子之一，在血管内皮细胞移行中起关键作用[8]。

玻璃体腔注射抗VEGF 药物是目前湿性AMD的一线治疗方法，但存在注射频率高、部分患者对药物应答延迟或不应答等局限性[9]，中医中药对该病的认识悠久，将其归属“视瞻昏渺”“视直如曲”“暴盲”等范畴，治疗经验丰富[10-12]。亢泽峰认为CNV 属“败络”范畴，是内邪日久化生内毒，毒浊目络而致络道亢进，异生血络（新生血管）[1]，临床化裁总结“加减驻景方”疗效显著[14-15]。

CNV 的发生发展受多种细胞的调控，如内皮细胞、周细胞、巨噬细胞等，这些细胞被激活后，释放细胞因子，调控血管生成。内皮细胞启动血管生成过程，主要包括血管内皮细胞出芽、增殖、迁移、分化、血管网形成等[16]，抑制血管内皮细胞增殖、迁移可以抑制血管生成。RF/6A 细胞和人类眼底血管内皮细胞具有高度同源性，是目前研究CNV 性疾病最常用细胞之一[17]，因此本部分实验以RF/6A 细胞为研究对象，通过外源性加入VEGF 模拟体内高VEGF 病理状态，初步观察药物Rg3 及康柏西普对其增殖和迁移的影响，从而为Rg3 干预CNV 形成的作用研究奠定体外实验基础。

研究发现，一定浓度的VEGF 刺激具有促进RF/6A 细胞增殖的作用，这和手术取出的CNV 膜标本存在VEGF 高表达相符。该研究中，50 ng/ml VEGF 促进作用最强，最佳作用时间为刺激作用48 h。康柏西普是我国首个自主研发并已获得SFDA 批准用于临床的一种新型受体融合蛋白抗VEGF 药物，本研究显示0.5 μg/ml 康柏西普即有抑制VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖作用，因此，选择0.5 μg/ml 康柏西普作为阳性对照药物。通过分别给予低、中、高浓度Rg3 干预VEGF 诱导后的细胞，观察对其增殖的影响发现，Rg3 对VEGF 诱导RF/6A 细胞增殖具有抑制作用，且在90 μmol/L 高浓度时抑制作用最强。细胞迁移率与细胞迁移能力成正比，迁移率越大，则药物干预对细胞迁移抑制作用越弱。本研究中细胞划痕实验检测结果显示，VEGF 诱导能够明显促进RF/6A 细胞迁移，迁移率最大。Rg3 和康柏西普分别干预后，其抑制作用从高到低依次为联合组、康柏西普组和Rg3 组，可见，Rg3 对VEGF 诱导后RF/6A细胞增殖和迁移的影响是同向的。

综上所述，人参皂苷Rg3 和康柏西普均能够有效抑制VEGF 诱导RF/6A 的细胞增殖与迁移，且联合组抑制作用最强。本研究为人参皂苷Rg3 可能作为有效抑制CNV 的潜在药物奠定了实验基础，但本实验为体外实验，尚需要进一步体内实验加以证明。