康柏西普对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用及其相关机制

崔双慧 朱梦云 郝泽宇 王剑锋 李娜 许澈

后发性白内障 (posterior capsular opacification, PCO) 是白内障患者手术后常见的并发症，影响患者视功能的恢复，可造成严重的视力损害。术后残存的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)的增殖、移行、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是PCO发生的原因[1]。目前临床上尚无有效的方法预防PCO。康柏西普是一种可溶性的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体诱导剂，玻璃体腔内注射常用于治疗眼内新生血管性疾病，在眼内应用的安全性和有效性已得到证实[2]。有研究显示,VEGF可促进LECs的增殖[3]。白内障手术破坏了晶状体前囊膜的屏障功能，使LECs能够与房水以及玻璃体腔注射的物质直接接触[4]，因此，玻璃体腔内注射康柏西普可能影响LECs的功能。本实验观察不同浓度的抗VEGF药物康柏西普对LECs增殖的影响及其相关机制，为临床预防和治疗PCO提供理论支持。

资料与方法

一、材料与试剂

人晶状体上皮细胞株SRA01/04购自广州赛库生物技术有限公司，康柏西普购自成都康弘生物科技有限公司，胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gibco公司，MTT试剂、Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，一抗Bax、Bcl-2相关蛋白购自Proteintech公司，山羊抗兔二抗购自北京中山金桥有限公司。

二、方法

分组：分为对照组(0 mg/ml)和四个不同浓度的康柏西普，康柏西普的浓度分别是(0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml)。

细胞培养：在37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下，用含15%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养细胞，细胞传代周期为2～3 d，对照组不加康柏西普，康柏西普组加入不同浓度的康柏西普，实验用对数生长期细胞。

1.MTT法检测细胞存活率：收集对数生长期的细胞，以5万/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后第2天更换培养基并加入不同浓度的康柏西普，继续培养24、48、72 h，取出96孔板，各孔均加入20 ulMTT溶液,孵育4 h,4 h后取出96孔板，弃旧的培养基，各孔均加入150 ulDMSO,酶标仪上震荡10 min，检测OD-490 nm各孔的吸光值,同时设置调零组，计算存活率。细胞存活率=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%。

2.Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率：收集对数生长期的细胞，以20万/孔接种于6孔板中，培养至细胞贴壁，第二天更换培养基并加入不同浓度的康柏西普，72 h收集各组的旧培养液于15 ml离心管中，PBS洗涤细胞，收集PBS至各自的离心管中，用不含EDTA胰酶500 ml消化细胞约3 min，将细胞悬液移至15 ml离心管中，离心后弃上清，用1 mlPBS重悬细胞，计数后，每组取20万细胞于对应编号的1.5 ml离心管中，离心后弃上清，分别加入200 ul结合液重悬细胞，按照凋亡试剂盒说明进行染色，避光孵育20 min，300目过滤网过滤，进行细胞凋亡检测。

3.Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax和bcl-2的表达水平：收集对数生长期期的细胞，以20万/孔接种于6孔板中，培养至细胞贴壁，第二天更换培养基并不同浓度的康柏西普，培养至72 h时提蛋白，BCA检测蛋白浓度，煮蛋白，计算蛋白上样量(20 ug体系)。配胶，蛋白上样，电泳约1.5 h，转膜1.5 h,脱脂牛奶封闭2 h,洗膜，孵一抗，4 ℃摇床过夜，洗膜，孵二抗，37 ℃恒温水浴箱孵育2 h，洗膜，曝光。曝光结束后得到目的条带，分析凋亡促进蛋白Bax、凋亡抑制蛋白bcl-2的相对表达量。

三、统计学分析方法

结 果

一、MTT法检测不同浓度康柏西普对LECs存活率的影响

MTT法结果显示康柏西普作用于SRA01/04细胞24、48、72 h，在相同时间点，随着康柏西普浓度的增加，SRA01/04细胞的存活率逐渐降低。同一康柏西普作用浓度，随着作用时间的延长，SRA01/04细胞的存活率亦呈逐渐降低的趋势。在相同的时间点比较，0.1 mg/ ml组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05),0.5 mg/ml组，1.0 mg/ml组，2.0 mg/ml组与对照组相比均具有统计学意义(P<0.05)；进一步行两两比较，结果显示：2.0 mg/ml组SRA01/04细胞存活率<1.0 mg/ml组SRA01/04细胞存活率<0.5 mg/ml组SRA01/04细胞存活率<0.1 mg/ml组SRA01/04细胞存活率(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度的康柏西普对晶状体上皮细胞存活率的影响

二、不同浓度的康柏西普对晶状体上皮细胞凋亡率的影响

流式细胞仪结果显示 不同浓度的康柏西普作用于SRA01/04细胞72 h后，细胞的凋亡率呈逐渐增加的趋势，与对照组相比，均具有统计学意义。0.1 mg/ml组与对照组相比(P<0.05),0.5 mg/ml组，1.0 mg/ml组，2.0 mg/ml组与对照组相比具有显著差异(P<0.001)。见表2，图1。

表2 不同浓度的康柏西普对晶状体上皮细胞凋亡率的影响

图1 a示P<0.05与对照组和0.1 mg/ml组相比；b示P<0.05与0.5 mg/ml组相比；c示P<0.05与1.0 mg/ml组相比

三、不同浓度的康柏西普对晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

Western Blot结果显示 不同浓度的康柏西普作用于SRA01/04细胞72 h后，凋亡促进蛋白Bax的表达水平均升高，0.1 mg/ml组与对照组相比无统计学意义(P>0.05)，0.5 mg/ml组，1.0 mg/ml组，2.0 mg/ml组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平随着康柏西普浓度的增加逐渐下降，与对照组相比均具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

讨 论

PCO是引起白内障患者术后视力再次下降的主要原因，其形成的主要机制是术后残存的晶状体上皮细胞的增殖，移行和上皮-间质转化[5]。手术方式的改进、人工晶状体材料的选择和形状的改进以及抗炎和抗代谢药物的使用在一定程度上延缓了PCO的发生，但并未从根本上解决，且抗炎抗代谢药物因其对眼内其他组织的毒性，限制了在临床上的应用[6]。目前用于治疗PCO的方式主要是钇铝石榴石激光晶状体囊切开术(Nd:YAG laser),其可能会引起眼压升高、葡萄膜炎、人工晶状体损害、视网膜脱离、黄斑囊样水肿等并发症[7]。因此，寻找预防和治疗后发性白内障的方法具有重要的意义。

图2 流式细胞仪检测不同浓度康柏西普对晶状体上皮细胞凋亡率的影响，与对照组相比，*示P<0.05,***示P<0.001

康柏西普是分子量为143KD的融合蛋白，可以结合VEGF-A的所有亚型、VEGF-B和胎盘生长因子(Placental growth factor , PGF)，影响其发挥相应的作用。康柏西普在治疗眼内新生血管性疾病，脉络膜新生血管及糖尿病视网膜变性伴黄斑水肿时，取得了很好的效果，其在眼内应用的安全性和有效性已被证明[2, 4, 8, 9]。Wang等[7]通过研究发现，高浓度和高频率在兔的玻璃体腔内注射康柏西普在短时间内其对视网膜无明显毒副作用，视网膜对其可耐受[10]。玻璃体腔内注射康柏西普用于治疗增生性糖尿病性视网膜病变时，可降低房水中VEGF和PIGF的水平，然而玻璃体腔内PIGF的含量并未降低，其原因可能与玻璃体基质有关[11]。Yao等[12]在玻璃体摘除的兔眼模型中研究发现，在兔眼玻璃体腔注射剂量为0.5 mg/眼的康柏西普后，注射眼房水中的康柏西普浓度仅可达到0.26±0.10 μg/ml。临床上康柏玻璃体腔注射的剂量为0.5 mg/0.05 ml，因此，药物到达房水中的浓度也将非常低，对LECs将产生何种影响尚未知。

晶状体是不含血管的透明组织，处在相对缺氧的环境，这对于维持晶状体的透明是非常重要的。研究显示LECs表达VEGF和VEGFR，VEGF对晶状体的发育具有重要作用。VEGF对LECs的增殖具有促进作用，与VEGF的浓度呈剂量-效应关系[3，13]。抗VEGF药物康柏西普作为治疗眼内新生血管疾病的一线药物，可以结合VEGF的多种亚型，玻璃体腔内注射康柏西普可能对LECs产生一定的影响，从而影响PCO的形成。

本研究发现，随着康柏西普浓度的增加，LECs的存活率逐渐降低。Jun等研究发现，抗VEGF药物贝伐单抗在(0.1 mg/ml～2.0 mg/ml)对体外培养的永生化的晶状体上皮细胞-B3的存活率、增殖具有促进作用，且与浓度呈正相关，可能与本实验所培养的细胞株不同、不同药物的作用机制不同有关。有研究表明，血管内皮因子受体拮抗剂阿替西尼对体外培养的晶状体上皮细胞FHL124的生长具有抑制作用[14]，本实验结果也显示康柏西普对LECs的增殖具有抑制作用。同时，本研究结果显示0.1 mg/ml的康柏西普即可发挥促进凋亡的作用(P<0.05)，随着康柏西普浓度的升高，凋亡促进蛋白Bax的表达水平升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量逐渐降低，说明康柏西普能够促进LECs的凋亡。

不同浓度的康柏西普均可促进LECs的凋亡，Bax的表达升高，bcl-2的表达降低，但是低浓度时(0.1 mg/ml)，康柏西普对LECs的存活率无明显影响，Bax的表达水平也无统计学意义。推测，在低浓度时细胞的凋亡率升高，可能与Bcl-2的水平降低有关，在浓度升高时，LECs的凋亡率升高，LECs增殖受到抑制，可能是Bax和Bcl-2共同发挥作用的结果。因此，康柏西普抑制LECs的增殖可能是通过促进Bax的表达，抑制bcl-2的表达来实现的。

本实验从不同的方面观察不同浓度的康柏西普对LECs的影响，其可发挥抑制LECs增殖，促进LECs凋亡的作用。本实验的不足之处是未对影响LECs增殖和凋亡的其他因素进行探讨。另外，本实验所用康柏西普浓度明显高于临床用药时在房水中的浓度，临床上是否可以通过提高用药浓度抑制LECs增殖，以预防和治疗PCO，有待进一步研究。