育胞颗粒对雷公藤多苷片致早发性卵巢功能不全大鼠卵巢功能的影响

陈怡瑾 杨亚莉 王云欢 王必勤 包晓霞

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退,促性腺激素水平升高(卵泡刺激素，follicle-stimulating hormone，FSH)>25 U/L,雌激素水平波动性下降，主要表现在月经的异常，如月经稀发、闭经等[1]。同时，也会由于雌激素水平降低而出现围绝经期综合征的症状，严重影响女性身心健康和生活质量。POI病因尚不明确，目前认为主要与遗传、环境、医源和代谢等多种因素相关，多种原因导致卵巢原始卵泡数目减少或卵泡闭锁加速、卵泡功能被破坏等，进而影响排卵[2]。POI近年来发病率逐年上升且年轻化，亟待安全有效的治疗方法。目前研究证实了中医药通过调节激素水平、改善卵巢形态、调节免疫系统等多个方面来治疗POI[3]。育胞汤是北京中医药大学东直门医院著名妇科专家郭志强教授的经验方，在临床多年的使用中已证实对POI患者有显著的疗效。本研究通过育胞汤的颗粒剂(育胞颗粒)治疗早发性卵巢功能不全大鼠，治疗后检测大鼠激素水平及卵巢相关激素和受体的表达，提供分子机制方面的实验依据，印证其对于早发性卵巢功能不全的改善作用并对其改善作用的分子机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雌性SD大鼠，8周龄，体重220～250 g，由北京中医药大学东直门医院实验室提供。在室温(22±2)℃、湿度(50±5)%、12小时昼夜明暗交替，自由饮食的环境，分笼适应性喂养5天后，每天上午同一时间段进行阴道细胞学涂片，连续观察两个动情周期，筛选出有正常动情周期者为受试动物。实验过程中对动物处置符合中华人民共和国科学技术部颁布的实验动物管理条例的规定。

1.2 实验药品

雷公藤多苷片，10 mg/片，50片/盒，浙江得恩德制药有限公司，国药准字：Z33020422。枸橼酸氯米芬(克罗米芬)，50 mg/片，10片/盒，MEDOCHEMIE LTD(塞浦路斯)，国药准字：H20140688。

郭志强教授经验方育胞汤药物组成：枸杞子15 g、女贞子15 g、黄精15 g、熟地黄15 g、菟丝子15 g、淫羊藿12 g、川断15 g、党参15 g、益母草15 g、川芎12 g、当归15 g。育胞颗粒由北京康仁堂药业有限公司提供(枸杞子，批号：18008951；酒女贞子，批号：18001632；酒黄精，批号：17023221；熟地黄，批号：18002131；盐菟丝子，批号：18008521；炙淫羊藿，批号：18010691；续断，批号：18012771；党参，批号：18017781；益母草，批号：18010252；川芎，批号：18019833；当归，批号：18016761)。

1.3 主要试剂

抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)多克隆抗体免疫组化试剂盒为北京博奥森生物技术有限公司产品，孕激素受体(progesterone receptor,PR)多克隆抗体免疫组化为博士德生物公司产品。p-PKA antibody、Actin antibody为Abcam公司产品，Goat Anti-Rabbit IgG、 HRP、Goat Anti-Mouse IgG为Santa公司产品，RIPA裂解液为碧云天公司产品，BSA缓冲液、30%丙烯酰胺为Amresco公司产品。

1.4 主要仪器

双垂直电泳槽、转移槽、电泳仪购自CAVOY,温控摇床购自其林贝尔,光谱扫描多功能读数仪购自赛默飞世尔科技,烤片机购自Leica Biosystems Nussioch GmbH,显微镜摄像头购自美国DIAGNOSTIC,恒温箱购自上海福马实验设备有限公司。

1.5 造模方法

将具有正常动情周期的SD雌性大鼠以生理盐水配制的雷公藤多苷片(40 mg·kg-1·d-1)悬浮液灌胃[4-5]，剂量为1 mL/100 g，1 次/天，共10周，自灌药日起，每日进行阴道涂片，观察记录动情周期。全部大鼠动情周期破坏，则造模成功。

1.6 分组和给药方法

将造模成功的SD雌性大鼠30只，随机分为育胞颗粒组、克罗米芬组、空白对照组各10只，每5只一笼。育胞颗粒组：育胞颗粒临床日用量159 g生药。换算动物临床等效剂量[5]，大鼠用量为16.70 g生药/kg。每剂颗粒剂溶解于生理盐水至95.21 mL，即1.67 g生药/mL，按1 mL/100 g，每天1次，大鼠灌胃7天。克罗米芬组将克罗米芬片研成粉末，将其悬浮于50 mL无菌生理盐水中，配成0.52 mg/mL克罗米芬悬浮液。按照5.2 mg克罗米芬·kg-1·d-1即1 mL/100 g，每日1次，大鼠灌胃7天。空白对照组按1 mL/100g，每日1次生理盐水，灌胃7天。灌药期间继续每日行阴道涂片检测。

1.7 检测指标

1.7.1 取材和处死 所有动物在完成操作24小时后处死，腹主动脉取血4 mL，静置离心后取上清液，分离出双侧卵巢组织，分别置于4%多聚甲醛液中固定、-80℃备用。

1.7.2 酶联免疫吸附法检测大鼠血清AMH激素水平 检测大鼠血清AMH激素水平，按照酶联免疫吸附法试剂盒说明书操作进行。

1.7.3 免疫组化法检测大鼠卵巢组织ER和PR的表达 卵巢组织进行石蜡包埋切片，切片60℃烤片30分钟，二甲苯脱蜡,酒精水化，微波炉内不同温度进行抗原修复，避光加3% H2O2处理15分钟，滴加封闭液孵育30分钟，后滴加配比好的一抗,孵育4℃过夜。次日给予二抗孵育，PBS洗5次，DAB避光显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察染色结果。免疫组织化学染色结果处理：卵巢组织标本中细胞胞质出现淡黄色或黄色颗粒状着色为阳性表达，摄像记录后采用Image-proplus 6.0图像处理在同等条件下检测每张组织切片中表达的平均积分光密度(A)值。

1.7.4 Western blot检测大鼠卵巢组织中PKA的表达 取三组大鼠卵巢加入适量RIPA裂解液，匀浆，冰上裂解进行蛋白提取。调整蛋白浓度，煮沸变性。取等量蛋白样品，电泳，转膜，Western blot封闭液封闭，第一抗体(稀释浓度1∶500)与靶蛋白结合，然后第二抗体与第一抗体结合。室温下，PBST缓冲液中洗膜4次，每次5分钟，ECL反应、暗室胶片曝光，显影并定影。采用Quantity One v.4.6.2软件读取条带灰度值，求每个蛋白印记的灰度值，与内参的灰度值的比值，作为被检测蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清AMH激素水平情况

与空白对照组比较，育胞颗粒组与克罗米芬组均出现AMH增高的现象，育胞颗粒组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，克罗米芬组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，育胞颗粒和克罗米芬组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。 如表1所示。

表1 各组POI大鼠血清AMH激素水平情况比较

注： 与空白对照组比较，Z=10.774，aP<0.05。

2.2 各组大鼠卵巢组织中ER、PR表达情况

与空白对照组比较，育胞颗粒组与克罗米芬组均出现ER和PR增高的现象，且差异有统计学意义(P<0.05)；育胞颗粒和克罗米芬组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。如表2和图1、图2所示。

表2 各组POI大鼠卵巢组织中ER、PR表达情况比较

注： 与空白对照组比较，Z=10.402、13.272，aP<0.05。

注： A：育胞颗粒组；B：克罗米芬组；C：空白对照组。

图1各组POI大鼠卵巢ER表达情况(免疫组化×400)

注：A:育胞颗粒组；B:克罗米芬组；C:空白对照组。

图2各组POI大鼠卵巢PR表达情况(免疫组化×400)

2.3 各组大鼠卵巢组织中PKA表达情况

根据Western blot检测结果，如表3、图3所示，对照组大鼠卵巢组织存在少量PKA的表达。与对照组相比较，克罗米芬组、育胞颗粒组PKA表达均显著升高(P<0.01)；与育胞颗粒组相比，克罗米芬组PKA的表达明显更高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 各组POI大鼠卵巢组织中PKA表达情况比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.01。

图3 各组POI大鼠卵巢组织中PKA的表达

3 讨论

早发性卵巢不全既往亦称为“卵巢早衰”，早在《内经》中就首次提出了“早衰”，并且定义“早衰”的年龄为 “年四十”，这与现代的认识相吻合。该病虽在中医学中无直接对应的病名，根据症状可认为其属于中医“月经过少”“月经后期”“闭经”“不孕”等病的范畴。《素问·六节藏象论篇》云：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也”，《傅青主女科》认为“经水出诸肾”“经本于肾”。《素问·上古天真论篇》提到：“女子二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子。”《景岳全书·妇人规》：云“此证最多，所以当辨而治之……而肾气日消，轻则或早或迟，重则渐成枯闭。”肾藏精，主生殖，肾气充盛，气血旺盛，冲任二脉充盈，协调作用于胞宫，则月经如期而至。郭志强教授认为肾藏精气是天癸至、经调子嗣的根本，而妇人阴血常虚状态是妇科疾病发病的重要内因，认为该病与肾、肝、脾、冲任密切相关，主要病位在肾。郭志强教授自拟的育胞汤中女贞子、枸杞子补肾益精共为君药；熟地黄补血养阴、填精益髓，黄精健脾益肾、补气养阴，共助君药补肾益精为臣药；菟丝子、续断、淫羊藿温补肾阳，取其阳中求阴之义；党参、益母草益气活血；当归、川芎补血活血。育胞汤主要用于经后期，经后期经水即行、陈祛新生，根据经后期阴长阳消，阴血渐复，达到重阴的生理特点，此时胞宫、冲任空虚，故应以滋补肝肾(阴)，养血调经为主，为阴阳转化氤氲之时奠定基础。临床研究发现，育胞汤联合其他方剂组成的周期疗法能改善卵巢功能低下患者的激素水平及卵巢功能，显著提高临床妊娠率，临床有效率达到92.3%[6]。

克罗米芬是目前临床运用广泛的促排卵药物，对雌激素有强的拮抗作用和弱的激动作用。拮抗是通过竞争性占据下丘脑雌激素受体，影响内源性雌激素的负反馈，促使垂体促性腺激素分泌的增加，从而刺激卵泡生长。至卵泡成熟后，弱的雌激素激动作用通过正反馈激发排卵。克罗米芬还可以通过增强颗粒细胞对促性腺激素的敏感性和芳香化酶的活性[7]。在卵巢组织中育胞颗粒组的ER和PR与克罗米芬组没有明显差异，但都比空白对照组有显著增高。研究表明，ER的数量对雌激素发挥作用有较为重要的影响[8]。本研究发现育胞颗粒可以上调大鼠卵巢组织内ER和PR的数量，增加雌二醇及孕激素的水平，有助于提高受损的卵巢功能。但是，目前国内外尚无克罗米芬对于卵巢功能不全大鼠卵巢ER、PR影响的研究。

抗苗勒管激素(AMH)主要是由窦前卵泡和小的窦卵泡上的颗粒细胞产生，可以抑制卵泡的生长过快及募集过程，从而导致卵巢无排卵，防止卵泡消耗过早过快[9-10]。卵巢功能不全主要为卵巢储备功能低下，这主要与卵巢卵母细胞质量及数量相关，血清内的AMH水平能够很好地反应出卵巢内窦卵泡数量[11]。AMH水平受到其他激素的影响较小，也不受下丘脑-垂体-卵巢轴的影响，能稳定的反映出卵巢功能[12]。本研究发现育胞颗粒可以提高卵巢功能不全大鼠血清AMH水平，从而提高卵巢储备功能，促进卵巢功能恢复。

PKA即cAMP依赖蛋白激酶，简称激酶A。最新研究显示，PKA与卵母细胞的减数分裂密切相关。在排卵前，PKA一定的活性保证了卵母细胞减数分裂停滞，LH高峰后，伴随着PKA活性的下降，减数分裂再次启动[13]。PKA也促进了GnRH对FSH分泌的作用，但GnRH对LH的促进作用不明显[14]，同时PKA介导了FSH对于排卵前卵泡成熟过程中颗粒细胞的分化以及FSH促进颗粒细胞tPA的表达的过程，进而引起排卵[15-16]。同时，有研究发现PKA激动剂能够提高卵泡的质量，抑制卵泡的闭锁[17]。本研究结果显示，育胞颗粒组及克罗米芬组PKA表达较空白对照组明显升高(P<0.01)，提示药物组POI大鼠卵泡成熟过程的重启，卵泡质量也明显提高。PKA蛋白介导的通路在卵泡成熟、排卵等过程中都发挥了一定的作用，因此，可以认为克罗米芬、育胞颗粒均可能通过PKA通路对POI大鼠的卵泡成熟等产生正面的作用。虽然克罗米芬组PKA的表达较育胞颗粒组明显增多，但在卵泡生长及排卵等一系列的过程中除PKA相关的通路外还有很多的通路在介导各个过程的发生及变化，因此要进一步明确育胞颗粒对POI大鼠的作用及机制须纳入更多相关通路的研究。

克罗米芬虽然可以促进卵巢排卵功能，但是因其具有雌激素拮抗作用，会引起宫颈黏液粘稠、拉丝度低、阻止精子进入，还可影响子宫内膜发育，减少子宫血流供应，使内膜和卵泡发育不同步，从而降低受精卵着床率。克罗米芬能够提高卵巢排卵率，但是临床妊娠率低。在临床使用中发现育胞颗粒不仅能够促进卵巢功能恢复，促进卵巢排卵，还不会影响子宫内膜厚度，但其具体作用的机制还有待进一步研究。本实验旨在明确育胞颗粒对POI的治疗作用的基础上初步探究相关机制，分组简单，所纳入的指标也较少，有诸多不完善之处，在未来须进行更加科学、深入的研究进一步明确育胞颗粒治疗POI的相关机制。