逍遥散对肝郁证失眠大鼠行为学的影响及作用机制研究

王韵桥 蒋筱 夏猛

大量研究表明，失眠与肝郁之间在症状层面及疾病层面上均具有密切的联系。如有学者的调查发现，失眠患者常伴有焦虑情绪、抑郁情绪，甚至是同时伴有两种情绪障碍[1]。另外，有学者则专门对儿童进行调查后发现，很多儿童存在睡眠问题，且原因多是因学习或生活环境因素造成的不良情绪[2]。在中医学中，这一类疾病被称为肝郁证失眠，且往往治疗困难，易反复，并导致多种并发症的发生，甚至致残、致死[3]。由此可以发现，无论是不断升高的发病率还是其严重的潜在危害，肝郁失眠都需要引起高度重视。大量的文献表明，中医经典方逍遥散具有疏肝理气、健脾养血的作用，在临床上对肝郁证失眠患者的治疗中收获了显著的疗效，但是对于其治疗肝郁证失眠的具体作用机制尚不明确。

PI3K/Akt-mTOR是一种在真核细胞中存在较广的信号通路[4-5]，对细胞自噬、凋亡和各种代谢等生命活动有着重要的调控作用[6]。本次实验中，课题组以逍遥散作为研究对象，选择临床上治疗肝郁证失眠的常用且效果明显的药物地西泮作为西药组。以PI3K信号通路为切入点，运用Real-Time PCR技术对各组大鼠海马体样本中的相关蛋白进行检测，同时结合旷场实验对各组大鼠进行行为学实验，分析逍遥散对于肝郁证失眠模型大鼠行为学的影响，为逍遥散治疗肝郁证失眠的切实疗效提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠50只，体重(200±20) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2016-0002，湖南省实验动物质量合格证号：43004700037830。适应性饲养1周之后开始实验。

1.2 药品制备

逍遥散(柴胡15 g、当归15 g、白芍15 g、白术15 g、茯苓15 g、生姜15 g、薄荷6 g、炙甘草6 g)，天王补心丹(酸枣仁10 g、柏子仁10 g、当归身10 g、天门冬10 g、麦门冬10 g、生地黄12 g)购买自广西中医药大学第一附属医院。经中药植化室鉴定符合《中国药典》2010版相关要求。

药剂制备：加水回流提取2次，第一次加10倍水提取2小时，第二次加8倍水提取1.5小时，药液过滤，合并浓缩至含生药浓度1 g/mL，4℃无菌保存备用，用时稀释适当浓度；地西泮片(广东三才石岐制药有限公司，批号：170913)，用时以生理盐水稀释至1 mg/mL备用。

对氯苯丙氨酸(para-chlorophenylalanine,简称PCPA)制备：将PCPA放入弱碱性生理盐水中溶解，配制成40 mg/mL混悬液。

1.3 主要试剂及仪器

PCPA(Sigma，批号:64898MJ)；Trizol(Invitrogen，批号:15596-026)；无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)；DEPC水(北京索莱宝科技有限公司)；RIPA裂解液(北京索莱宝，批号:R0010)；PI3K抗体(Abcam，批号:ab151549)；Akt抗体(Abcam，批号:ab8805)；MTOR抗体(Abcam，批号:ab32028)；UVP凝胶成像系统(Thermo，CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 System)；荧光定量PCR仪(ABI，7500)；水平电泳仪(北京市六一仪器厂)；半干转膜仪系统(ATTO，WSE-4040)。

1.4 模型制备

从大鼠中随机选择6只作为空白组，剩余大鼠采用慢性夹尾刺激和腹腔注射PCPA复合因子造模法进行肝郁证失眠大鼠模型制备[7]。将同一组大鼠置于同一笼中，用止血钳将除空白组外所有大鼠的尾部夹住，每天持续刺激45分钟，令大鼠相互厮打，为保证存活率，以大鼠不受明显外伤为度进行强度控制，连续20天；造模第16天，开始对各组模型大鼠按1 mL/100 g腹腔注射之前配置好的PCPA混悬液，连续3天。

1.5 动物分组及给药

除去空白组6只，最终得到逍遥散高剂量组6只、逍遥散中剂量组6只、逍遥散低剂量组6只及天王补心丹组6只、地西泮组(西药组)6只，模型组6只。各组大鼠从造模第7天起，以临床人与大鼠体表面积换算每日给药：逍遥散高剂量组5 mL/kg、逍遥散中剂量组及天王补心丹组2.5 mL/kg、逍遥散低剂量组1.25 mL/kg、西药组0.1 mL/kg，空白组和模型组每日给予等量生理盐水。共持续2周，在给药2周后进行旷场试验及指标检测。

1.6 取材

大鼠水迷宫实验完毕后，进行断头低温新鲜取脑。大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头，置于冰台上迅速分离海马，放入-80℃液氮中保存，每组取材6只。

1.7 检测指标

1.7.1 宏观体征观察 观察实验过程中各组大鼠的精神、活动、睡眠、饮食、毛色的变化。

1.7.2 旷场实验 由Morris视频分析系统进行试验测试，在电脑Morris系统中将旷场分为九个象限，每一象限为大小相同的方格。之后将大鼠置于最中心的象限，记录时间设置为3分钟，在3分钟之内记录其移动的距离、跨越方格的数量以及活动次数(梳理毛发、站立和探索动作)作为检测指标，以评估其活跃程度的变化。

1.7.3 Real-Time PCR实验 引物序列：引物由天根生物科技有限公司设计并提供，详见表1。实验步骤：用Trizol提取组织样本中总RNA，取RNA用琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性,用TIANScript RT KIT进行反转录，实验操作按产品说明书进行，RT-PCR运用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.7.4 Western blot实验 按说明书提取各组大鼠海马组织蛋白；用BCA试剂盒测定并调整每个样本蛋白浓度之后上样；连接电泳装置及电源，电压设为120V恒压，1.5小时后停止电泳；用封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)室温封闭2小时，用新配制的封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜；用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗，室温下孵育膜1小时，PBST洗膜用于图像采集；加ECL工作液，在凝胶成像仪下曝光成像。

表1 引物序列

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 肝郁证大鼠宏观体征观察

造模前各组大鼠精神状态良好，睡眠、活动、饮食正常，毛质光泽柔顺。造模1周之后，各模型组大鼠与空白组相比，精神萎靡，活动明显减少，饮食减少，毛色暗淡，清洁行为减少，易受外界刺激。两周之后对外界刺激反应开始减弱，开始表现出明显的肝郁证相关症状。药物治疗之后，逍遥散高剂量组、逍遥散中剂量组及西药组情况改善明显。在造模前、造模后灌胃前、灌胃后三个时间节点分别对各组大鼠体重进行记录并计算每组平均体重，发现造模期间各模型大鼠体重持续下降，药物治疗之后，各药物组大鼠体重基本停止减少，逍遥散高剂量组、逍遥散中剂量组及西药组大鼠体重开始恢复。

2.2 肝郁证大鼠旷场试验结果

给药治疗后，与空白组比较，模型组和天王补心丹组移动距离明显缩短，跨越方格数和活动次数减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，接受给药治疗的各组，除天王补心丹组大鼠以外，移动距离明显增加，跨越方格数和活动次数增多，差异有统计学意义(P<0.05)。其中逍遥散中剂量组及西药组变化最为明显，大鼠活跃善程度更高。而天王补心丹组与模型组比较，移动距离、跨越方格数和活动次数相近，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组肝郁证失眠大鼠旷场试验测试

注： 与空白组比较，aP<0.05，与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05。

2.3 肝郁证大鼠RT-PCR检测结果

RT-PCR结果显示：与空白组相比，各治疗组PI3K、Akt、mTOR表达量均有增加，其中除天王补心丹组及逍遥散低剂量组，其余各组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，除天王补心丹组及逍遥散低剂量组外，其余治疗各组PI3K、Akt、mTOR表达量均上调，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中逍遥散中剂量组和西药组上调最为明显，治疗效果最好，见表3。

表3 各组肝郁证大鼠的PI3K、Akt、mTOR的表达

注： 与空白相比比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05。

2.3 肝郁证大鼠WB检测结果

WB结果显示：与空白组相比，各治疗组PI3K、Akt、mTOR表达量均有增加，其中除天王补心丹组及逍遥散低剂量组，其余各组间差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，除天王补心丹组及逍遥散低剂量组外，其余治疗各组PI3K、Akt、mTOR表达量均上调，差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中逍遥散中剂量组和西药组上调最为明显(P<0.01)，治疗效果最好，见表4、图1。

表4 各组肝郁证大鼠PI3K、Akt、mTOR的蛋白表达

注： 与空白相比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05。

注：A：空白组；B：模型组；C：逍遥散低剂量组；D：逍遥散中剂量组；E：逍遥散高剂量组；F：天王补心丹组；G：西药组

图1Western blot检测肝郁证大鼠CA1区PI3K、Akt、mTOR蛋白印迹表达图

3 讨论

随着中医对细胞层面研究的不断深入，现代细胞研究也为中医的理论研究提供了新的思路。目前中医对于这一类研究的成果主要体现在以下几个方面：阴阳理论，寻求人体阴阳的动态平衡也中医的基本治疗思路。黄贵华等[8]认为细胞自噬过程是阴阳动态平衡的微观体现。许文婷等[9]对这一观点有了更为详细的描述：细胞自噬与凋亡是以细胞的对立制约并相互作用为基础的。这些研究成果，和中医理论中关于阴阳理论的描述基本一致；肝郁气滞作为一种更为细致的病因病机，是中医失眠中的常见证型，在临床上常与情志性疾病相关。大量研究证明了mTOR通路在抗抑郁及调节人的情志方面起着重要作用[10]。同时PI3K/Akt信号传导通路作为细胞自噬的经典通路，也表明了通过调控细胞自噬通路可以达到疏肝解郁，调节人体情志的作用。同时有学者认为如果细胞自噬被抑制，受损和衰老的细胞器得不到及时清除，废物堆积损害人体健康，这个过程也与肝气不疏相通[11]。

综上，可以发现PI3K信号通路作为一种作用十分广泛的信号通路，它对人体的阴阳平衡、气机条畅有着十分重要的作用密切的联系，其中与情致相关的疾病联系尤为密切。但是作为如今高发疾病，目前医学界对肝郁证失眠的作用机制研究仍非常有限，且大部分并未在细胞技术层面予以深入的研究观察，目前的研究成果提示，肝郁证失眠可能与PI3K/Akt信号通路也具有非常重要的联系。所以在本次实验中，课题组成功复制肝郁证失眠大鼠模型，而造模方法也与临床上肝郁证的常见病因类似，然后通过药物干预并观察、检测动物形态体征、行为学及相关蛋白表达的变化，来确定肝郁证失眠与PI3K/Akt信号通路的具体联系。

课题组发现，基于生物本身的自我修复功能和对疾病的应激反应，与空白组相比，模型组PI3K、Akt、mTOR表达量已经开始部分增加，但由于其程度有限，还达不到调控信号通路、条畅情志的作用；与模型组比较，逍遥散中剂量组及高剂量组和西药组PI3K、Akt、mTOR表达量明显上调，说明此时该信号通路得以进一步激活，开始逐步通过对该信号通路的控制达到治疗肝郁证失眠的目的；而逍遥散低剂量组与天王补心丹组的PI3K、Akt、mTOR表达量低于逍遥散中剂量组和西药组，这也与旷场实验中的结果相符，说明中药剂量的高低变化会对治疗结果产生影响，同时滋阴养血，补心安神的天王补心丹没有达到治疗肝郁证失眠的目的，这也提示中药复方需要在中医理论的指导下辨证施治，若药不对证，也同样达不到治疗目的。根据这一系列实验结果，提示逍遥散可能是通过上调肝郁证失眠模型大鼠的PI3K、Akt、mTOR蛋白表达，从而激活该信号通路，达到保护神经元，抗抑郁，并最终治疗肝郁证失眠的目的。这一结果与目前国内外其他类似研究的结果基本一致，但其具体的作用机制仍有待于进一步的研究。因为本实验仅为课题前期研究，课题组计划在今后的实验中，如条件允许，可以采用多检测方式、多细胞靶点、多信号通路同时进行，使实验结果更加符合复杂的临床情况，从而为中医治疗肝郁证失眠的治则治法提供客观依据，为今后研究疏肝解郁法治疗各种病症的具体作用机制抛砖引玉。