《金匮要略》“当先实脾”对肝损伤大鼠肝细胞凋亡的干预作用

郑智礼 史兴华 于瀚 张亿 高艺宁 魏伟莉 邓秀兰

“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”为仲景“治未病”的代表性原文。研究表明，实脾治肝常取得事半功倍的疗效，但现有研究多集中在肝脾同病、同调状态下的机制研究，而遵循《金匮要略》原旨，着眼于“当先实脾”之“先”，探讨其客观性的相关报道乏陈。基于此，本课题采用肝郁叠加慢性肝损伤大鼠模型，通过不同的分组及给药方式，复制“当先实脾”的治疗方案。从肝功能生化指标、肝组织病理学的观察结果评价模型及药效；从5h-尿木糖排泄率的检测结果探讨“知肝传脾”的客观性；通过对比正常组、模型组及各干预组上述指标的变化，寻求 “当先实脾”的生物学依据，通过检测肝凋亡指数(apoptotic index，AI)、肝组织B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)的表达，观察“当先实脾”对肝细胞凋亡的影响，为丰富和发展中医药防治肝病做出有益的科学探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠48只，雄性，体重(180±20)g，合格证号：SCXK(京)2016-0002，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。饲于室温(25±0.5)℃，相对湿度(55±5)%，采用 12小时明暗交替光照，自由摄食饮水。

1.2 实验药物及配置

阳性药：双环醇200 mg/kg[2-3]；柴芍六君子汤方：柴胡12 g、白芍15 g、党参15 g、茯苓10 g、炙甘草5 g、白术10 g、法半夏10 g、陈皮10 g、枳壳10 g、焦三仙各10 g；四逆散方：柴胡12 g、白芍15 g、枳壳10 g、炙甘草5 g；六君子汤方：党参15 g、茯苓10 g、炙甘草5 g、白术10 g、法半夏10 g、陈皮10 g、焦三仙各10 g。

实验用药均购自北京同仁堂医药药材有限公司，经北京中医药大学药用植物教研室鉴定，生药剂量比例按原著换算。各组药物常规煎煮3次，将3次滤液混合，将所得药液纱布过滤，水浴加热蒸发浓缩后贮于冰箱中备用。

1.3 实验仪器与试剂

全自动生化分析仪(CX4Pro,BECKMANCOULTER,USA)；光学显微镜(BX53,OLYMPUS,JAPAN)；全波长酶标仪(MultiskanGO,Thermo,USA)；荧光定量PCR仪(ABI,Steponeplus)；超微量分光光度计(Thermo,NanoDrop2000)。

尿木糖测试盒(A035，南京建成生物工程研究所)；GAPDH (GB12002，Servicebio)；Bax(GB11690，Servicebio)；Bcl-2(ab59348，abcam)；TUNEL试剂盒(11684817910，Roche)。

1.4 动物分组与造模

采用随机数字表法将48只大鼠分为6组，分别为正常组、模型组、双环醇组、柴芍六君子汤甲组、柴芍六君子汤乙组、柴芍六君子汤丙组，每组8只。造模同时灌胃给药，连续42天，正常对照组给予等容量纯净水。

参照慢性束缚法[1]，将模型组大鼠置于特制的束缚制动筒内(北京冀诺泰科技发展有限公司提供，长20 cm，内径5.5 cm，前端有滑塞，后部有压板)，通过移动固定器前端的滑塞逐步缩小大鼠活动空间，调节到其无强烈反抗的最小空间。每日束缚制动1次，开始时间随机，时长从第1天的4小时逐渐增至每天6小时，连续42天。所有大鼠在束缚期间禁食禁水。除正常组外，其余5组大鼠给予40%CCl4橄榄油溶液皮下注射(5 mL/kg体重，2次/7天)，正常组予等量橄榄油干预对照，见表1。

1.5 样本采集与检测方法

实验开始前1天分组称重。各组于实验第42天禁食12小时后灌服10% 尿木糖溶液5 mL/只，代谢笼收集大鼠5小时的尿液，离心取上清(3000 r/分钟,4℃,15分钟)。麻醉取血，离心取上清(3500 r/分钟, 4℃,15分钟)，于-80℃冻存备用。摘取肝组织右侧叶置于4%多聚甲醛溶液中固定，左侧叶及中叶于-80℃冻存以待检测。

1.5.1 肝组织病理学观察 肝组织4%多聚甲醛溶液固定后石蜡包埋，常规切片，苏木素-伊红(hema-toxylin-eosin，HE)染色后光镜下观察肝组织的病理变化。

1.5.2 肝功能生化检测 以全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、白蛋白(albumin，ALB)含量。

1.5.3 5h-尿木糖排泄率检测 计算公式：5h-尿木糖排泄率=(测试样浓度值×稀释倍数×5h尿样/1000)×100%

1.5.4 肝细胞凋亡指数检测 采用TUNEL法检测肝细胞凋亡。肝组织石蜡切片经脱腊水化后修复、破膜，按试剂盒说明书添加试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)，后DAPI复染细胞核[切片用PBS(PH 7.4)洗涤3次，每次5分钟。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10分钟]，后再置于PBS(PH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。荧光扫描采集图像，每张切片5个随机视野，计算凋亡指数，阳性凋亡细胞核为绿色。凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

1.5.5 肝组织凋亡基因Bax及Bcl-2检测 采用RT-PCR法检测肝组织中Bax、Bcl-2的相对表达量。提取肝组织总RNA并进行定量，逆转录合成cDNA，收集数据，确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数(Ct值)，进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线，根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。反应条件为50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，95℃ 15秒，60℃ 1分钟，最后两步重复40个循环。2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达强度，所有样本均重复3孔。引物设计方法见表2。

1.5.6 凋亡蛋白Bax及Bcl-2检测 采用Western blot法检测肝组织中Bax、Bcl-2蛋白相对表达量。取适量肝组织冰上融化，细胞裂解液处理，离心后取上清，通过电泳将蛋白分开并转至硝酸纤维膜上，用含5%的脱脂奶粉(0.5%TBST配)封闭1小时。稀释一抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA)，4℃孵育过夜(快转)，TBST室温下脱色摇床上洗三次，每次5分钟。二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30分钟后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5分钟，滴加荧光底物发光显色。Photo Shop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，Prism 6软件进行灰度统计。

表2 引物设计表

表3 各组大鼠血清肝生化指标对比

注： 与正常组对比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组对比，cP<0.05，dP<0.01。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肝组织病理学观察结果

肝组织病理学观察结果可见，正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，核圆居中，无明显肿胀、炎性细胞浸润及坏死。模型组大鼠肝小叶结构不清，肝细胞肿胀明显，并有炎性细胞浸润，部分肝细胞核明显偏位。双环醇组、柴芍六君子汤甲组、丙组大鼠肝小叶结构较清晰，部分肝细胞轻度肿胀，无明显炎性细胞浸润。柴芍六君子汤乙组大鼠部分肝细胞变形明显，部分细胞核移位，存在少量炎性细胞浸润。见图1。

2.2 血清肝功能生化检测结果

模型组大鼠血清ALP、AST、ALT浓度显著升高，ALB浓度显著降低，双环醇组、柴芍六君子汤甲组、乙组、丙组均可不同程度的改善肝郁叠加慢性肝损伤大鼠血清肝功能生化指标的异常改变，其中复制“当先实脾”治疗方案的柴芍六君子汤丙组对该模型大鼠血清肝功能生化指标的改善作用与双环醇接近，对该模型的干预作用优于其它中药干预方法。见表3。

注：A 正常组；B 模型组；C双环醇组；D柴芍六君子汤甲组；E柴芍六君子汤乙组；F柴芍六君子汤丙组。

图1各组大鼠肝脏组织病理学观察结果(HE×100)

2.3 5h-尿木糖排泄率检测结果

模型组大鼠5h-尿木糖排泄率显著降低，“先实脾”“先治肝”、双环醇均可不同程度的提高肝郁叠加慢性肝损伤大鼠5h-尿木糖排泄率，“先实脾”、双环醇对该模型大鼠5h-尿木糖排泄率的提高作用优于“先治肝”的治疗方式。见表4。

表4 各组大鼠5h-尿木糖排泄率对比

注： 与正常组对比，aP<0.05；与模型组对比，bP<0.05。

2.4 肝细胞凋亡计数检测结果

模型组大鼠AI显著高于正常组(P<0.01)；双环醇组、柴芍六君子汤甲组、乙组、丙组AI显著低于模型组(P<0.01)，其中丙组对肝细胞凋亡的调节最佳(P<0.05,P<0.01)。见表5、图2。

表5 各组大鼠肝细胞凋亡指数对比

注： 与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与柴芍六君子汤丙组比较，cP<0.05，dP<0.01。

注：A-C正常组；D-F模型组；G-I双环醇组；J-L柴芍六君子汤甲组；M-O柴芍六君子汤乙组；P-R柴芍六君子汤丙组。

图2各组大鼠肝细胞凋亡情况(TUNEL荧光扫描凋亡细胞图、正常细胞图、合成图 ×200)

2.5 肝细胞凋亡基因Bax、Bcl-2表达情况

模型组Bax基因表达较正常组显著升高(P<0.01)，Bcl-2基因表达显著降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2显著升高(P<0.01)。双环醇组及柴芍六君子汤甲组、乙组、丙组均有效改善模型大鼠肝组织Bax基因的异常表达(P<0.05,P<0.01)。双环醇组及柴芍甲组、丙组对模型大鼠肝组织Bcl-2的异常表达均有显著改善(P<0.05)。各种干预方式均可有效降低模型大鼠肝组织Bax/Bcl-2的异常升高(P<0.05,P<0.01)，其中复制“当先实脾”治疗方案的柴芍丙组对该基因的干预作用优于其它干预方式。见表6。

2.6 肝细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达情况

对比正常组，模型组大鼠Bax蛋白相对表达量升高但不显著，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，Bax/Bcl-2显著升高(P<0.05)；对比模型组，双环醇组及柴芍甲组Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，双环醇、柴芍乙、柴芍丙组Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05,P<0.01)。以上结果表明，双环醇、柴芍乙及柴芍丙组均可有效降低肝郁叠加慢性肝损伤模型大鼠肝组织的凋亡情况，其中柴芍丙组对两个蛋白相对表达量的干预作用最为显著。见表7、图3。

注：A:正常组；B:模型组；C:双环醇组;D:柴芍六君子汤甲组;E:柴芍六君子汤乙组;F:柴芍六君子汤丙组

图3各组大鼠肝组织Bax及Bcl-2蛋白泳道图

3 讨论

“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”是仲景“治未病”运用的重要体现。然针对“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的研究多集中于肝脾同病、同调，而严格遵循《金匮要略》原旨，探讨“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”客观证据及生物学机制的研究鲜有报道，在课题组前期研究基础上，本实验采用肝郁叠加慢性肝损伤大鼠模型复制“见肝之病”，通过不同分组先后给予不同药物干预，观察“知肝传脾，当先实脾”的生物学依据及其对肝细胞凋亡的影响。

表6 各组大鼠肝组织Bax及Bcl-2基因的表达情况

注： 与正常组对比，aP<0.05，bP<0.01；与模型组对比，cP<0.05，dP<0.01。

表7 各组大鼠肝组织Bax及Bcl-2蛋白的表达情况

注： 与正常组对比，aP<0.05；与模型组对比，bP<0.05，cP<0.01。

肝功能生化指标、肝组织病理学观察可以直观反映肝脏病变程度，二者为本实验评价“肝病”的重要指标。尿木糖主要在空肠内通过被动扩散的方式吸收，代谢过程不需肝脏、消化酶及肾小管参与，其吸收水平能够反映小肠吸收水平[4-5]。口服木糖后尿中排出的尿木糖正比于小肠的被动吸收能力，检测尿液5h-尿木糖排泄率可有效评价肠粘膜的吸收功能，为本实验评价“脾虚”的主要指标。

细胞凋亡是多途径、多基因调控下，自主有序的死亡过程[6-7]，这种生物过程的紊乱与多种疾病的发生、发展与转归密切相关，有研究表明肝细胞凋亡的紊乱是急慢性肝损伤的主要原因之一，而AI则为常用的评价凋亡程度的指标[8-9]。细胞凋亡途径可以分为外源性和内源性两种，即死亡受体通路和线粒体通路[10-11]，而线粒体途径则是公认为的细胞凋亡的中心环节[12]。研究发现，在众多凋亡调控基因中，Bcl-2家族是公认最有效的多基因家族，其中目前被认为和凋亡关系最密切的是Bcl-2和Bax。Bcl-2是公认的凋亡抑制基因，它编码的蛋白位于线粒体膜、内质网膜和核膜上，其抗凋亡作用机制为通过抗氧化应激及改善线粒体通透性，进而减少细胞色素C及凋亡诱导因子释放，最终抑制凋亡效应蛋白酶链激活[13-14]。当Bcl-2过表达时，可形成Bcl-2同源二聚体，能有效抑制各种因素诱导的细胞凋亡。而Bax是目前Bcl-2家族中被公认的促凋亡基因，一般来讲其定位于细胞质中，细胞受到损伤或感受外源性刺激后，被激活的Bax结合在线粒体膜上，建立线粒体膜通道，介导细胞色素C的释放，进而诱导细胞凋亡[15]。而Bax过度表达时，则形成Bax同源二聚体，直接启动或诱导细胞凋亡，或与Bcl-2结合成异源二聚体，抑制Bcl-2的抗凋亡作用的发挥[16]。因此，Bcl-2与Bax表达水平的平衡决定了凋亡信号刺激后细胞的存活或凋亡。而Bax/Bcl-2比值直接反应肝细胞凋亡程度，其改变可用以解释干预细胞凋亡的因素是否发挥促进或抑制细胞凋亡的作用[7-8, 17]。AI、Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2为本实验评价肝细胞凋亡及调节状况的重要指标。

本实验结果显示，模型组大鼠血清ALP、AST、ALT浓度显著升高，ALB浓度显著降低，肝组织病理学观察存在炎症、水肿等异常改变，提示模型组大鼠肝组织存在较严重病理损伤；模型组大鼠5h-尿木糖排泄率显著降低，表明肝病的同时存在小肠被动吸收功能障碍，即“见肝之病，知肝传脾”有其生物学依据。

各给药组大鼠血清肝功能生化指标、尿液5h-尿木糖排泄率及肝组织病理学观察结果表明，各给药组均可不同程度改善肝郁大鼠的肝功能、小肠被动吸收功能及肝组织病理损伤。三种中药干预方式组间对比结果显示，“当先实脾”之柴芍六君子汤丙组对肝郁叠加慢性肝损伤大鼠血清ALB、ALT、AST浓度调控作用优于其它给药组，“当先实脾”有其生物学依据。

模型大鼠AI指数显著升高，Bax在基因及蛋白层面的表达均显著升高，Bcl-2在两种层面的表达显著降低，Bax/Bcl-2显著升高；双环醇及三种中药方剂干预方式均显著降低模型大鼠的AI指数，其中柴芍丙组AI指数降低程度最接近正常组。从基因层面和蛋白层面来看，柴芍乙、丙组对Bcl-2、Bax的异常改变均具有调控作用，抗凋亡作用显著，其中柴芍丙组即复制“当先实脾”的治疗方案对凋亡基因/蛋白的异常表达调控效果最佳。

本研究表明，“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”有其生物学依据，“当先实脾”对肝郁叠加慢性肝损伤模型大鼠取得较好的干预作用可能与其对肝细胞凋亡的调节作用有关，肝细胞凋亡为“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”的生物学机制之一。