新型腺病毒载体肺结核疫苗的免疫原性研究①

史晓雨 隋秀文 苗 伟 高德进 王 畅 魏梦函 朱 涛

(天津科技大学，天津 300457)

结核病(tuberculosis，TB)是全球领先的传染性疾病杀手，新的结核病疫苗对于预这一流行病至关重要[1]。自从1921年引入目前唯一获得许可的卡介苗(Bacillus calmette guerin，BCG)以来，很少有新的候选疫苗或策略进入临床实验，并且BCG只有效保护儿童，对成人肺结核没有保护力[2]。Ag85A抗原是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)表面抗原中免疫原性最强的蛋白之一,主要诱导T细胞免疫应答[3]。单独接种Ag85A疫苗能够有效激发机体特异性免疫应答，从而抑制MTB侵染能力[4]。但是，MVA-85A新型肺结核疫苗在临床Ⅱb期的失败[5]说明，单独Ag85A抗原诱导的免疫应答，并不足以成功预防肺结核。相关文献指出，将MTB早期分泌靶点抗原ESAT6、杆菌潜伏期抗原rv3407、杆菌复苏相关抗原RpfB三个基因融合，Ad5作为病毒载体来表达3Ag融合蛋白，在小鼠模型中显示了很好的免疫原性[6]。本实验开发了一种以Ad5为载体的新型双价肺结核疫苗，涵盖了Ag85A、ESAT6、rv3407以及RpfB四种不同抗原，扩大了抗原的保护范围，为肺结核各个阶段提供较为全面的保护。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物 试验用鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，普通级别BALB/c雌性小鼠，4～6周龄。

1.1.2免疫材料及试剂 Ad5-TPA-3Ag与Ad5-Ag85A毒种均由康希诺生物股份公司纯化保存；ELISpot试剂盒购自瑞典Mabtech公司；细胞因子染色试剂盒购自德国美天旎生物技术有限公司；ELISA检测用辣根过氧化物酶标记(HRP*)的山羊抗小鼠抗体购自北京博奥龙免疫技术有限公司；ELISA平板与1640培养基购自美国康宁公司。

1.2方法

1.2.1单价和双价疫苗制备 Ad5-Ag85A单价疫苗以5×107IF U/ml剂量免疫，双价疫苗Ad5-Ag85A与Ad5-TPA-3Ag分别以1∶0.2、1∶1、1∶2、1∶4 剂量进行配制，同时设置生理盐水组作为阴性对照，充分混匀，备用。

1.2.2试验分组及免疫流程 BALB/c雌性鼠随机分配为六组，42只/组，共252只。第一组接种Ad-Ag85A单价疫苗，第二至第五组分别接种剂量比例为1∶0.2、1∶1、1∶2、1∶4的双价疫苗。共进行3次免疫，免疫间隔14 d，注射途径为后腿肌肉注射，100 μl/只。分别于每次免疫后28 d对小鼠眼球采全血及断颈处死，检测抗体效价和细胞因子水平。

1.2.3小鼠血清IgG抗体检测 原核表达的Ag85A和TPA-3Ag抗原包被浓度分别为1 μg/ml和0.25 μg/ml，4℃过夜。洗涤液(PBST)洗3次，使用1%BSA在37℃条件下封闭1 h。供试品血清进行倍比稀释，37℃孵育1 h。Ag85A板中的酶标抗体进行1∶8 000稀释，TPA-3Ag板中的酶标抗体进行1∶15 000稀释，37℃孵育1 h。TMB避光显色10 min，使用2 mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处测定吸光度值，阴性血清OD450平均值与2.1乘积为Cutoff值，样品血清OD450大于Cutoff值为阳性，对应最大稀释倍数作为抗体效价。

1.2.4小鼠脾细胞分离及体外刺激 小鼠断颈处死，取出脾脏，浸入3 ml RPMI1640培养基于培养皿中，剪碎研磨出脾细胞，400 g，4℃离心5 min。去上清，每脾加3 ml ACK裂解液常温裂解5 min，加入12 ml PBS终止裂解，400 g，4℃离心5 min。去上清后重悬于4.2 ml RPMI完全培养基中，分至96孔U板中，每孔2×106个细胞，100 μl/孔。分别加入用RPMI培养基稀释的Ag85A和TPA-3Ag肽库，终浓度2 μg/ml，终体积200 μl。充分混匀后置于37℃，5%CO2培养箱培养2 h后加入1∶1 500倍稀释的高尔基体阻断剂(GolgiStop)，每孔30 μl，继续刺激4 h后收集细胞，进行细胞染色。

1.2.5细胞内细胞因子染色(ICS) 经6 h刺激的脾细胞400 g，4℃离心5 min，弃上清，重悬于MACS缓冲液，100 μl/孔，并转移至96 V孔板，400 g，4℃离心5 min。准备MACS Buffer稀释好的CD3-FITC，CD4-PerCP荧光抗体，每孔50 μl，4℃避光孵育20 min。孵育结束后每孔加入150 μl PBS溶液，离心弃上清重悬于MACS缓冲液，充分吹打混匀，立刻加入Cytofix/Cytoperm TM Fixation and Permeabilizaiton Solution，150 μl/孔，反复吹打混匀，4℃过夜后离心去上清，每孔加入100 μl 1×Perm/wash Buffer，孵育5 min，400 g，4℃离心5 min。准备1×Perm/wash Buffer稀释好的IFNγ-PE和IL2-APC荧光抗体，每孔加入50 μl，4℃孵育30 min。结束后加入150 μl PBS溶液，离心去上清，重悬细胞于200 μl/孔MACS Buffer，混匀，4℃储存。分析时，转移至流式细胞仪分析用管，并加PBS至终体积500 μl上样。

1.2.6ELISpot检测IFN-γ 按照试剂盒说明书将ELISpot平板用70%乙醇活化2 min，加入浓度为5 μg/ml 抗小鼠IFN-γ抗体，4℃过夜包被，RPMI1640完全培养基室温封闭2 h。按照每孔1×105个细胞接种平板，每孔50 μl，Ag85A和TPA-3Ag肽库按照终浓度2 μg/ml分别与脾细胞1∶1 混合，同时设置PMA刺激孔作为阳性对照，无细胞刺激孔为阴性对照，置于37℃，5%CO2培养箱过夜培养。次日用PBS洗板5次拍干，加入以1∶1 000 PBS稀释的R4-6A2-biotin抗体，每孔50 μl，室温孵育2 h。孵育结束后弃去液体，PBS溶液洗5次，加入50 μl用PBS按1∶1 000倍稀释好的Streptavidin-ALP，室温孵育1 h。之后弃去液体，PBS洗5次，每孔加入100 μl BCIP/NBT，用0.45 μm滤膜过滤，直到出现明显的斑点，随后用大量纯化水温柔清洗以终止反应。晾干平板后读数。

1.3统计学处理 统计分析采用GraphPad InStat软件，对抗原特异性IgG的滴度ELISA检测，抗原特异性免疫应答细胞的ELISpot和ICS检测的结果进行分析，组间比较分析采用t检验，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1体液免疫应答评价 使用ELISA法检测小鼠血清中Ag85A特异性和TPA-3Ag特异性IgG抗体滴度，结果如图1所示。对于Ag85A特异性抗体反应结果，单价和双价疫苗均引起体液免疫应答；两次免疫抗体水平最佳；单价Ag85A优于各双组分疫苗，双价疫苗间无明显差异。对于TPA-3Ag特异性抗体滴度结果，双价疫苗各组均产生很强的体液免疫应答；第三次免疫抗体水平最高，效果最好；除双价1∶0.2剂量组一免IgG抗体滴度显著低于其他组外(P<0.05)，各双组分疫苗之间无差异。

2.2ICS结果 首先，划分出淋巴细胞中的CD4+细胞，再分析此细胞群落的IFNγ+、IFNγ+IL2+、IFNγ-IL2+细胞，结果如图2所示。

图3展示了Ag85A特异性细胞免疫检测。一免(A)、二免(B)和三免(C)后ICS检测Ag85A特异性CD4+T细胞的数量。图中可以看出，单价和双价疫苗均引起Ag85A特异性细胞免疫应答；一免时，1∶1剂量组比1∶2和1∶4组CD4+T细胞数量多，其他组无显著差异；第二次产生针对Ag85A特异性CD4+T细胞的数量最多，双价1∶1剂量组较1∶0.2组有明显差异，1∶4组有差异；三免中1∶1剂量组诱导CD4+T细胞比1∶0.2和1∶2组多，有差异。

图4反映了TPA-3Ag特异性细胞免疫检测。一免(A)、二免(B)和三免(C)后ICS检测TPA-3Ag特异性CD4+T细胞数量。一、二、三免中，各双价疫苗组均引起明显的细胞免疫应答；两针免疫表现效果最优，以1∶0.2剂量组最低，有差异(P<0.05)，其他双价组无明显差异；三免中1∶4配比组产生的TPA-3Ag特异性CD4+T细胞数量最多，其他剂量组无差异。

图1 Ag85A特异性和TPA-3Ag特异性IgG抗体滴度Fig.1 Titration of Ag85A-specific and TPA-3Ag-specific IgG antibodiesNote: *.P

图2 流式细胞仪划分细胞步骤Fig.2 Gating strategy of flow cytometry

图3 Ag85A特异性细胞免疫检测Fig.3 Ag85A specific cellular immunoassayNote: *.P P

2.3ELISpot结果 Ag85A特异性IFN-γ应答细胞的数量如图5所示。A、B分别表示二免和三免产生IFN-γ应答的细胞情况。单价和双价疫苗组均产生IFN-γ，且三免强度最大；二免时，各比例组无明显差异；三免中，以双价1∶1配比组产生IFN-γ应答细胞最多(P<0.05)。

对于TPA-3Ag特异性IFN-γ应答细胞数量情况，如图6所示。各双价配比组均有相应IFN-γ应答细胞产生，且三针免疫诱导的响应细胞普遍比二免多；二免时，各组无显著性差异(图6A)；三免中(图6B)，双价1∶1组明显优于其他剂量组(P<0.05)。

图4 TPA-3Ag特异性细胞免疫检测Fig.4 TB3-Ag specific cellular immunoassayNote:*.P

图5 Ag85A特异性细胞免疫检测Fig.5 Ag85A specific cellular immunoassayNote:*.P

图6 TPA-3Ag特异性细胞免疫检测Fig.6 TB3Ag specific cellular immunoassayNote:*.P

3 讨论

MTB是结核病的病原体，是导致死亡的主要原因[7]。2017年，大约有1 000万人患上结核病，其中有160万人死于这种疾病，23%的世界人口有潜在结核病感染的风险，因此开发一款有效对抗结核病的疫苗刻不容缓[8]。复制缺陷型腺病毒载体安全性高，具有无佐剂参与便能引起针对病原体更为快速、有效保护效果的优点，对于预防病毒类病原体具有强大的潜力，成为疫苗领域常用的病毒载体[9]。由于腺病毒与结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)作用的靶器官均为肺，因此有文献报道使用腺病毒作为载体开发对抗结核病的新型疫苗[10]。本研究在Ag85A抗原基础上，引入MTB另外三种抗原(ESAT6、rv3407、RpfB)，通过增加结核分枝杆菌不同时期的抗原，对结核病的发作进行全面预防。实验通过两种腺病毒疫苗的不同比例，进一步评价其免疫原性。

体液免疫应答结果表明，对于Ad5-Ag85A，单价Ad5-Ag85A疫苗在三次免疫下均产生体液免疫应答，且高于各组双价疫苗。Ad5-TPA-3Ag的加入，并没有增强针对Ag85A的抗体应答，反而会有抑制；针对TPA-3Ag，双价疫苗各组均产生很强的体液免疫应答；三免效果最好，且各组无明显差异。

ICS结果表明，对于Ag85A特异性细胞免疫检测，三次免疫下，各双价疫苗均产生了特异性CD4+T细胞，且1∶1剂量组表现出更好的优势。对于免疫针次，两次免疫诱导产生的特异性CD4+T细胞普遍偏高。

ELISpot结果显示，无论从Ag85A还是TPA-3Ag角度分析，两免产生的对应IFN-γ应答细胞数量比三免低，三免中以1∶1 配比最佳，其他组无差异。

大量研究表明，结核病的预防以诱导细胞免疫保护为主，即消灭细胞内病原体的免疫保护力。因此，检测抗原特异性Th1类免疫应答，即检测分泌IFN-γ细胞因子的CD4 T细胞，是评价细胞免疫保护作用的重要指标[11]。针对三免后细胞免疫应答普遍下降情况，可能与腺病毒预存免疫有关。人体内存在较高针对5型腺病毒的抗体水平，多次免疫可降低病毒载体的转录及表达，从而降低免疫原性[12]。

综上所述，双价疫苗能够诱导产生良好的体液免疫和细胞免疫应答，有望成为新型肺结核疫苗。