“远志-石菖蒲”药对治疗阿尔茨海默病的作用机制研究

罗 虹，刘凯丽，王 艳

(山西中医药大学，山西 晋中 030619)

药对是临床常用的两味药物的配对形式，能起到协同作用，或增强药性，或相互制约、缓解毒性[1]。远志与石菖蒲伍用，名曰远志汤，出自《圣济总录》，可治久心痛。远志芳香清冽、辛温行散、宁心安神、散郁化痰；石菖蒲辛散温通、利气通窍、辟浊化湿、理气化痰、活血止痛。远志通于肾、交于心，石菖蒲开窍启闭宁神。二药伍用，可通心窍、交心肾、益肾健脑聪智，开窍启闭宁神之力增强[2]。

远志为远志科植物远志(polygalatenuifoliawilld.)或卵叶远志(polygalasibiricaL.)的干燥根，主要含有三萜皂苷、糖酯类化合物以及香豆素、木质素、黄酮、生物碱等成分[3]。远志味苦、辛，性微温，归心、肾、肺经，具有宁心安神、祛痰开窍、消散痈肿的功效，主治惊悸、失眠健忘、癫痫发狂、咳嗽痰多、痈疽疮毒、乳房肿痛等[4]。《名医别录》中云远志：“定心气，止惊悸，益精，去心下膈气，皮肤中热，面目黄。”其临床功效主要为“宁心安神、祛痰开窍、消散痈肿”[4]。

石菖蒲为天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根茎，含挥发油0.11%～0.42%，包括为β-细辛醚、α-细辛醚、石竹烯、α-葎草烯、石菖醚、细辛醚等，尚含有氨基酸、有机酸和糖类等其他成分[5-6]。石菖蒲性温，味辛、苦，归心、胃经，具有开窍醒神、化湿开胃、宁心安神的功效，主治脘痞不饥、噤口下痢、神魂癫痫、健忘耳聋[5-6]。《药性论》云：“治风湿顽痹，耳鸣，头风，泪下，杀诸虫，治恶疮疥瘙。”《神农本草经》云：“主风寒湿痹，咳逆上气，开心孔，补五脏，通九窍，明耳目，出音声。”

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种渐进性的中枢神经系统的退行性变性病，主要表现为认知功能障碍、日常生活能力下降和精神行为异常[7]。中医学文献中没有阿尔茨海默病这一病名，相关临床表现的大量论述散见于痴呆、呆病、善忘、文痴、神呆、郁证等疾病的论述中[8]。皇甫谧在《针灸甲乙经》中以“呆痴”命名，虞抟《医学正传》谓之“愚痴”，《资生经》名曰“痴证”，痴呆病名首见于汉代《华佗神医外传》，杨继洲的《针灸大成》则分别以“呆痴”和“痴呆”命名，明代《景岳全书·杂证谟》第一次提出“痴呆”是独立性疾病[9]。

本研究利用网络药理学方法研究远志-石菖蒲药对治疗阿尔茨海默病的相关机制。网络药理学从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质，适用于阐释中药多成分-多靶点的作用关系[10]。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

TCMSP V2.3.0数据库、PubChem数据库、SWISS数据库、TTD数据库、Uniprot Database数据库、DAVID V6.8.0数据库、Cytoscape V3.7.0软件及其Bisogenet插件、CytoNCA插件、ClueGO插件。

1.2 远志与石菖蒲中有效成分筛选

通过TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology)数据库查找相关文献，获取中药化学成分相关信息，以口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18[11]作为条件，筛选远志与石菖蒲中的有效成分。OB为口服药物吸收至体循环的速度与程度，反映了药物生物活性分子类药性的优劣[12]。

1.3 药物有效成分靶点网络构建

将上述步骤筛选出的有效成分名称输入PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，获取每一成分的SMILES结构式及2D结构或3D结构，输入SWISS数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获得药物成分靶点，根据probability≥0.7[13]标准进行进一步筛选。

利用Cytoscape3.7.1软件，将筛选后的远志与石菖蒲的主要活性成分名称及其对应靶点数据导入，生成成分靶点可视化网络。通过String数据库选择需要的蛋白质相互作用，构建远志、石菖蒲药物有效成分靶点PPI网络。

1.4 阿尔兹海默病相关靶点网络构建

在TTD数据库(https://db.idrblab.org/ttd/)中Search drugs and targets by desease or ICD identifier一栏输入疾病的英文名称(Alzheimer disease)获得疾病一级靶点。在TCMSP数据库中选择Disease name一栏，输入Alzheimer disease，搜索疾病相关靶点，两种方法得到的靶点取交集确定为疾病相关的靶点[14]。使用Uniprot Database数据库(https://www.uniprot.org/)选择物种为“human”的靶点，将蛋白名称和基因名称进行转换。

利用Cytoscape软件将疾病靶点数据导入Cytoscape得到疾病靶点可视化网络。通过String数据库，输入基因列表，构建疾病靶点PPI网络。原则：物种智人(Homo Sapiens)。

1.5 交集网络构建及生物通路分析

先利用Bisogenet插件分别构建药物成分靶点PPI网络和疾病靶点PPI网络，再采用Cytoscape中的merge工具得到一个成分靶点和疾病靶点的交集网络，并用Cytoscape中的CytoNCA插件对该网络中每个节点的拓扑参数进行评估分析，选择degree值≥2倍中位数的靶点作为核心靶点，得到一个更细致的交集网络。使用DAVIAD数据库对核心靶点进行富集分析，选择GO分析和KEGG分析，得到富集分析通路，进行进一步讨论。

2 结果

2.1 远志及石菖蒲有效成分筛选

按照上述筛选条件得到石菖蒲活性成分4个，从文献中筛选出石菖蒲活性成分2个，共计6个，分别为木脂素类、黄酮醇类、挥发油等成分。远志活性成分6个[15-16]，为皂苷类、甾醇类等成分。两药共筛选得到12个活性成分(如表1)，获取180个靶点蛋白，根据probability≥0.7[13]筛选得到靶点共44个。

表1 远志-石菖蒲药对中的12个活性成分

2.2 远志-石菖蒲有效成分靶点PPI网络

将筛选出的12个活性成分及其对应靶点相连构建成分靶点PPI网络，见图1。40个靶点中，除2个靶点没有产生交互关系，其余38个节点均有交互关系，产生68条边，degree(节点通过边的个数)平均值为3.58，平均聚类系数为0.441，P-value<0.01。

图1成分靶点PPI网络

2.3 阿尔兹海默病靶点PPI网络

在 TTD数据库中与阿尔茨海默病有关的一级靶点共95个，在TCMSP数据库中与阿尔茨海默病相关的靶点有30个，对两种方法得到的靶点取交集，共得到14个阿尔茨海默病一级靶点，见表2。构建疾病靶点PPI网络如图2所示，14个靶点中有1个没有参与蛋白相互作用，13个靶点有蛋白相互作用。网络图包括13个节点，31条边，节点度degree平均值为4.43，平均聚类系数为0.492，P-value<0.01。

表2 阿尔茨海默病靶点

图2疾病靶点PPI网络

2.4 远志-石菖蒲有效成分靶点与阿尔茨海默病靶点交集网络

采用Cytoscape中的merge工具得到一个成分靶点和疾病靶点的交集网络，共287个节点。根据数据显示该交集网络的degree中位值为11，设定筛选范围为degree值≥22，共76个节点，构建PPI网络，见图3。其中有两个靶点没有产生互交，74个靶点产生363条互交关系，节点度degree的平均值为9.55，平均聚类系数为0.553，P-value<0.01。

2.5 生物通路分析结果

将交集网络核心靶点的基因键入DAVID数据库中进行KEGG分析和GO分析。KEGG分析共导出通路74条，GO分析共导出263条，选择P<0.01[11]的通路，再按照相关性排序，结合文献筛选得到KEGG通路5条(见表3)，GO通路2条(表4)。KEGG分析结果显示，PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路可能是远志-石菖蒲药对治疗阿尔茨海默病的相关信号通路。GO分析结果显示，beta-catenin-TCF复合物组装、MAPK级联(MARK cascade)等通路与远志-石菖蒲药对治疗阿尔茨海默病有关。

图3成分靶点与疾病靶点交集PPI网络

表3 KEGG分析结果

表4 GO分析结果

3 讨论

本研究通过网络药理学方法，构建远志-石菖蒲成分靶点及阿尔茨海默病相关靶点网络，对分子水平上揭示远志-石菖蒲治疗阿尔茨海默病的机制进行探索。通过药物化学成分分析，得到远志-石菖蒲药对主要有效成分12个。药物有效成分靶点与疾病靶点交集图印证了远志-石菖蒲药对治疗阿尔茨海默病涉及多个活性成分、靶标以及通路。生物通路分析结果显示，远志-石菖蒲药对治疗阿尔兹海默病的机制与调节PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路、雌激素信号通路等有关。

PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶)信号通路是维持细胞正常生理功能的重要信号转导途径，可以调节细胞分裂、分化、迁移、骨架重排等生理过程，同时具有肯定的抗凋亡效应[17]。 PI3K-Akt信号通路与阿尔茨海默病的发生与发展具有一定的联系，通过改变PI3K-Akt信号通路表达可以实现对阿尔茨海默病发病机制的调节[18]。PI3K被细胞外信号活化后，可激活下游蛋白激酶Akt。在阿尔茨海默病的发病过程中，凋亡相关基因Bad、GSK-3、转录因子家族、caspases家族等参与了神经元的凋亡，导致神经元的大量丢失，而活化的Akt通过磷酸化Bad、GSK-3、转录因子家族、IB、caspases等使促凋亡基因失活，从而起到抑制神经元凋亡及促进神经元存活的作用，进而减少阿尔茨海默病神经元的大量丢失，改善阿尔茨海默病的病理变化[19]。激活PI3K-Akt信号通路可促进Bcl-2表达，缓解HIBI引起的神经元凋亡，从而发挥脑保护作用[20-21]。

ErbB信号不足与神经退行性疾病的进展有关，如阿尔茨海默病[22]。有证据表明，NRG/ERbB信号在大脑中存在一个最优水平，偏离这一水平会损害大脑功能[23]。阿尔茨海默病中的突触丢失、胶质增生、炎症和神经元死亡等病理变化与神经调节蛋白-1(NRG-1)及其受体erbB2、erbB3和erbB4的表达改变有关[24]。

在雌激素信号通路中，雌激素激活雌激素受体ER和GPR30。阿尔茨海默症患者中有2/3为女性，该病女性患病率高与绝经期间卵巢性激素的丧失有关[25]。阿尔茨海默患者大脑白质中雌激素受体β显著减少[26]，雌激素受体β的作用之一在于降低阿尔茨海默病大鼠海马体中的炎症反应水平和β淀粉样蛋白沉积程度，并提高学习和记忆能力[27]。

MAPK信号通路是细胞内的一条蛋白质链，其将细胞表面受体的信号传递给细胞核内的DNA，非正常MAPK级联的功能与癌症、糖尿病、自身免疫性疾病和发育异常等疾病的诱导和发展有关[28]。

4 结论

网络药理学分析结果表明，远志-石菖蒲药对中的有效成分治疗阿尔茨海默病可能通过PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路、雌激素信号通路等发挥作用。本研究为该药对健脑作用的相关机制提出了预测，为其进一步研究奠定了基础。