正交试验优选百芩止咳颗粒提取工艺

冯建安，李 希*，张 海，杨 雷，侯丰爵，李双双

(1.四川省中医药科学院 中医研究所，四川 成都 610031；2.成都中医药大学 药学院，四川 成都 610075)

咳嗽为呼吸系统疾病的常见症状。随着自然环境及气候变化，咳嗽的发病率呈现不断上升的趋势。百芩止咳合剂为四川省中医药科学院中医研究所(四川省第二中医医院)临床使用30余年的经验方，疗效显著，此方由黄芩、陈皮、百部等药味组成，具有清热解毒、化痰止咳的功效，用于风热咳嗽、痰多，对肺热咳嗽、急慢性支气管炎属热型疗效显著。方中黄芩清热燥湿、泻火解毒[1，2]，善清肺火及上焦之实热，用于治疗肺热咳嗽，现代药理学研究表明，黄芩还有解热镇痛、抗菌消炎等作用[3-6]，为治疗咳嗽的常用中成药之一[7]。陈皮主要包含橙皮苷为主的黄酮类及挥发油等燥湿化痰成分，用于湿痰咳嗽[8]。陈皮既能燥湿化痰，又能温化寒痰、理气健脾、辛散苦泄而能宣肺止咳，为治痰之要药[9]，现代药理学研究还发现，橙皮苷具有降低胆固醇、促进胃肠蠕动、抗炎等功能[10，11]，与黄芩共为君药，发挥清热解毒、化痰止咳之功效。现根据处方药味的主要药效成分的理化性质以君药黄芩和陈皮中的黄芩苷和橙皮苷转移率及干膏收率为评价指标，通过正交试验优选水提取工艺，为本制剂的开发研究提供工艺条件参数。现将研究过程报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器；黄芩苷对照品(批号：110715-201318)；橙皮苷对照品(批号：10721-201617)；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含量测定

2.1.1 溶液配制 对照品溶液制备：取在60 ℃条件下减压干燥4 h的黄芩苷对照品8.45 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.338 mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液制备：精密量取“正交试验”项下的浓缩液1 mL，加甲醇至50 mL，超声处理20 min，冷却，加甲醇定容至50 mL，滤过，取滤液，即得。

阴性样品溶液制备：取缺黄芩的药材，按正交试验提取，按“供试品溶液的制备”项下方法同法制成阴性样品溶液。

2.1.2 色谱条件及专属性考察色谱柱Agilent Eclipse XDB- C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Agilent 1260型高效液相色谱仪，DAD二极管阵列检测器；流动相为甲醇-0.4%磷酸(40∶60)；流速：1 mL/min；柱温25 ℃，进样量10 μL；紫外检测波长：280 nm。分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液按照上述色谱条件进行试验，记录结果。结果显示，阴性样品在黄芩苷峰处无干扰，表明所用方法专属性良好。见图1。

注：Ⅰ黄芩苷对照品；Ⅱ样品；Ⅲ阴性样品

2.1.3 黄芩苷线性关系考查分别精密吸取黄芩苷对照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别得到浓度为67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、338 μg/mL 的对照品溶液。采用高效液相色谱法进行试验，分别精密吸取各浓度黄芩苷对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按照“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积，测定结果见表1。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，黄芩苷对照品的浓度(X)(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，见图2，并计算回归方程：Y=32.819X+42.556(r=0.999 7)；结果表明：在67.6～338.0 μg/mL范围内，黄芩苷峰面积积分值与进样量的线性关系良好。

表1 黄芩苷线性关系考察

注：r=0.999 7。

图2黄芩苷标准曲线

2.1.4 精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验精密吸取对照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交试验”项下的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定，计算RSD分别为1.54%、0.40%，表明仪器精密度良好。

精密吸取对照品溶液(0.338 mg/mL)，量取“正交试验”项下供试品溶液各10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色谱仪，测定，RSD值分别为0.80%、0.23%，均小于3%，表明对照品溶液、供试品溶液在24 h内稳定。

精密量取提取液6份，每份1 mL，按照“供试品溶液的制备”方法进行处理，并按照上述色谱条件测定，RSD=0.86%(n=6)，表明所用方法重复性良好。

精密量取上述已知提取液9份，每份20 mL，分别按高、中、低浓度精密加入对照品溶液，按照“供试品溶液的制备”方法进行处理，并按照上述色谱条件测定，平均回收率=99.6%，RSD=1.01%(n=9)，表明所用方法准确度良好。

2.1.5 样品含量测定分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定，以外标法计算黄芩苷的含量。黄芩苷转移率(%)=测得黄芩苷含量(mg/g)/药材中黄芩苷含量(mg/g)×100%。

2.2 橙皮苷的含量测定

2.2.1 溶液配置对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品12.70 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.508 mg/mL的橙皮苷对照品溶液。

供试品溶液制备：精密量取“正交试验”项下的浓缩液10 mL，浓缩至干，加甲醇至50 mL，超声处理20 min，冷却，加甲醇定容至50 mL，滤过，取滤液，即得。

阴性样品溶液制备：取缺陈皮的处方药材，按正交试验提取，按“供试品溶液的制备”项下方法同法制成阴性样品溶液。

2.2.2 色谱条件及专属性考察 色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-6%冰醋酸(24∶76)；流速：1 mL/min；进样量为10 μL；柱温30 ℃；紫外检测波长：283 nm。分别量取阴性样品溶液、样品溶液、对照品溶液按照上述色谱条件进行试验，记录结果。结果显示，阴性样品在橙皮苷峰处无干扰，表明所用方法专属性良好。见图3。

2.2.3 橙皮苷线性关系考察 分别精密吸取橙皮苷对照品溶液2、4、6、8 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别得到浓度为67.6 μg/mL、135.2 μg/mL、202.8 μg/mL、270.4 μg/mL、508 μg/mL的对照品溶液。按照高效液相色谱法试验，分别精密吸取橙皮苷对照品溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色谱仪，按照“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积，测定结果见表2。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，橙皮苷对照品的含量(X)(μg)为横坐标，绘制标准曲线(图4)，并计算回归方程：y=3733.6x+307.03(r=0.999 7)；结果表明在0.1016～0.508 mg/mL范围内，橙皮苷峰面积积分值与进样量的线性关系良好。

表2 橙皮苷线性关系的考察

注：r=0.9997。

2.2.4 精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验 精密吸取对照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交试验”项下的供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定，计算RSD值分别为0.80%、0.93；RSD值均小于3%，表明仪器精密度良好。

精密吸取对照品溶液(0.508 mg/mL)，量取“正交试验”项下的供试品溶液各10μL，分别于0、2、4、8、12、24 h，注入液相色谱仪，测定，RSD值分别为0.79%、0.59，均小于3%，表明对照品溶液、供试品溶液在24 h内稳定。

精密移取提取液6份，每份10 mL，按照“供试品溶液的制备”方法进行处理，并按照上述色谱条件测定，RSD=0.93%(n=6)，表明所用方法重复性良好。

精密移取上述已知提取液9份，每份20 mL，分别按高、中、低浓度精密加入对照品溶液，按照“供试品溶液的制备”方法进行处理，并按照上述色谱条件测定，平均回收率=100.6%，RSD=1.31%(n=9)，表明所用方法准确度良好。

2.2.5 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定，以外标法计算橙皮苷的含量。橙皮苷转移率(%)=测得橙皮苷含量(mg/g)/药材中橙皮苷含量(mg/g)×100%。

注：Ⅰ对照品；Ⅱ样品；Ⅲ阴性样品

图4橙皮苷标准曲线

2.3 干膏收率

用移液管精密吸取提取浓缩液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，计算干膏收率。干膏收率=测得干膏重(g)/正交试验用药材的量(g)×100%。

2.4 正交试验

采用水煎煮提取的方法，影响水提效果的因素主要有药材粉碎粒度、提取温度、加水量、煎煮时间、煎煮次数等。根据汤剂的制备方法、药材所含成分的性质和制剂生产的实际情况，药材采用饮片形式以水煎煮提取数次，即可充分浸出有效成分。因此，对加水量、煎煮时间和次数3个因素各设3个水平，按照L9(34)正交表安排试验，因素水平，见表3。

按处方比例称取药材75g，按表中正交试验条件进行提取，过滤，滤液浓缩至200 mL，备用。按照“2.1.5”和“2.2.5”项下方法分别测定黄芩苷、橙皮苷转移率，按照“2.3”项下方法测定出膏率，并将3项综合加权评分为指标，权重系数分别定为0.4、0.4、0.2，考察各因素对提取工艺的影响。结果见表4、表5。

表3 试验因素水平

表4 正交试验结果

注：W=X*40+Y*40+Z*20。

表5 方差分析

由表4直观分析结果可知，影响提取效果的因素顺序为：C>B>A，即煎煮次数>煎煮时间>加水倍数，最佳提取工艺条件为A3B3C3；由表5方差分析结果可知，B3与B2相差不大，将B3调整为B2，并结合生产实际，从节约能耗出发，将C3与 C2对比验证，即进行3次A3B3C3、A3B2C2的对比验证试验。

2.5 对比验证试验

按A3B3C3、A3B2C2工艺条件，分别进行3组平行试验，结果见表6。

表6 对比验证试验结果

由表6可知，工艺条件A3B3C3与工艺条件A3B2C2所得结果黄芩苷转移率、橙皮苷转移率、干膏收率、综合评分均相差不大，且工艺稳定。因此，为节约能耗，选择水煎煮工艺为加8倍水，煎煮2次，每次1.0 h。

3 讨论

百芩止咳颗粒主要功效为清热解毒、化痰止咳，用于风热咳嗽、痰多。本研究工艺采用水提取，保证了与原汤剂物质基础和疗效的一致性。查阅组成本方的药物，其所含的有效成分主要为黄酮类、生物碱类等成分，能印证提取工艺的合理性。采用本实验优选后的提取工艺，其主要有效成分黄芩苷和橙皮苷的转移率均较高，为本方改良为颗粒剂和提升质量标准提供了依据。

本实验主要选用黄芩苷及橙皮苷的含量为主要评价指标，对提取工艺进行正交设计，优化其制备工艺，确定百芩止咳颗粒的最佳提取工艺。但由于中药复方的复杂性，只对君药的黄芩和陈皮的有效成分进行了含量测定，而未对其他成分进行含量测定，所以评价指标还不够全面。如果在工艺提取优选过程中，同时对提取液主要药效进行对比验证，将使优选更加准确。