射干麻黄汤质量标准研究
2020-04-10安俐瑶姜英子徐雅娟
安俐瑶，姜英子* ，徐雅娟
(1.延边大学，吉林 延吉 133000；2.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130021)
射干麻黄汤出自《金匮要略》，由射干、麻黄、生姜、细辛、紫菀、款冬花、大枣、半夏、五味子组成[1]，临床上常用于治疗痰饮咳嗽，寒痰、湿痰引起的喉中痰鸣[2]。郝文梅[3]发现射干麻黄汤治疗痰湿阻肺型咳嗽疗效较佳，该方能够清除由长期咳嗽产生的咽喉部郁热从而达到很好的镇咳效果。脾为生痰之源，肺为储痰之器，咳嗽不止则中不安，中不安则痰饮续生，因此，治痰饮应先镇咳，止住咳嗽，温肺化饮之药才能更好地发挥作用。射干作为方中主药苦寒清热、解毒化痰[4]。五味子收敛肺气，用于久咳虚喘，细辛温肺化饮[5-7]。本研究对射干麻黄汤中的次野鸢尾黄素、五味子醇甲、细辛脂素同时进行含量测定，为射干麻黄汤的质量控制提供参考。
1仪器与试剂
高效液相色谱仪SHIMADZU LC-20AT；METTLER AG245十万分之一天平、甲醇、乙腈为色谱纯(TEDIA)，水为娃哈哈纯净水；次野鸢尾黄素对照品(中国食品药品检定研究院，111557-201703)，五味子醇甲对照品(中国食品药品检定研究院，110857-201714)，细辛脂素对照品(中国食品药品检定研究院，111889-201705)，射干麻黄汤干膏(自制)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为SHIMADZU VP-ODS(250 mm×4.6 mm×5 μm)。流动相为乙腈(A)-水(B)，0～20 min，35%A～45%A；20～30 min，45%A～50%A；30～30.5 min，50%A～70%A；30.5～45 min，70%A～100%A。检测波长287 nm，流速1 mL/min，柱温40 ℃。
2.2对照品溶液的制备
精密称取次野鸢尾黄素对照品、五味子醇甲对照品、细辛脂素对照品，加甲醇制成每1 mL含44 μg次野鸢尾黄素、168.8 μg五味子醇甲、35.2 μg细辛脂素的混合溶液。
2.3供试品溶液的制备
取约2.50 g射干麻黄汤的干膏粉，加入10 mL甲醇超声30 min，用甲醇补足减失重量，样品过0.22 μm的微孔滤膜过滤。
2.4阴性样品溶液的制备
按照最佳工艺制备阴性样品干膏，样品1不加射干，样品2不加五味子，样品3不加细辛。按照“2.3”项制备供试品溶液，得阴性1、阴性2、阴性3样品。
2.5方法学考察
2.5.1线性关系考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，注入高效液相色谱仪，得到6组峰面积，以进样量μg为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，得到次野鸢尾黄素的回归方程为y=2 045 185.37x+73.39，r=0.999 9，表明次野鸢尾黄素在0.088 0～0.880 0 μg之间具有良好的线性关系；五味子醇甲的回归方程为y=326 122x-100.66，r=0.999 9，表明五味子醇甲在0.337 6～3.376 0 μg之间具有良好的线性关系，细辛脂素的回归方程为y=1 403 945.87x+2 329.92，r=1，表明细辛脂素在0.070 4～0.704 0 μg之间具有良好的线性关系。
2.5.2精密度考察 精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μL/次，连续进样6次，次野鸢尾黄素峰面积的RSD值为0.09%，五味子醇甲峰面积的RSD值为0.11%，细辛脂素峰面积的RSD值为0.11%。说明仪器精密度良好。
2.5.3重现性考察 取同一批号样品6份，按照“2.3”项下制备供试品溶液。分别精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，测定次野鸢尾黄素、五味子醇甲、细辛脂素的含量。次野鸢尾黄素的平均含量为0.022 7%，RSD值为2.62%；五味子醇甲的平均含量为0.071 6%，RSD值为2.21%；细辛脂素的平均含量为0.018 2%，RSD为0.41%。对照品、供试品、空白对照图谱见图1-图3。
注：1.次野鸢尾黄素；2.五味子醇甲；3.细辛脂素
图1 射干麻黄汤供试品色谱
注：1.次野鸢尾黄素；2.五味子醇甲；3.细辛脂素
图2 射干麻黄汤对照品色谱
图3 空白对照溶液色谱
2.5.4加样回收率考察 取同一批供试品6份，取样量约1.25 g，精密加入3种对照品，按照“2.3”项下制备供试品溶液。分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，结果见表1-表3。
表1 次野鸢尾黄素加样回收率试验
表2 五味子醇甲加样回收率试验
表3 细辛脂素加样回收率试验
根据加样试验结果，次野鸢尾黄素的平均加样回收率为97.02%，RSD为0.29%，五味子醇甲的平均加样回收率为96.33%，RSD为0.26%，细辛脂素的平均加样回收率为98.43%，RSD为0.31%，说明本方法可行。
2.5.5稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h末注入高效液相色谱仪，测得次野鸢尾黄素的峰面积RSD为2.06%，五味子醇甲峰面积的RSD为1.87%，细辛脂素峰面积的RSD为0.43%。表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.6样品测定
取3批样品按“2.3”项下制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪进行分析，外标法计算含量。见表4。
表4 不同批次射干麻黄汤中次野鸢尾黄素、五味子醇甲、细辛脂素的含量测定结果 (mg/g)
3讨论
3.1提取条件的考察
3.1.1提取方式的考察 考察了超声处理(220 V，50 Hz)和加热回流提取两种提取方式，在相同的提取时间内，超声法对样品中3种成分的提取效率优于回流提取法。
3.1.2提取溶剂的考察 分别使用甲醇、甲醇∶水(8∶2)、乙醇三种溶剂对等量样品进行超声处理，在相同的提取时间内，甲醇对供试品中3种成分的提取效率最优。
3.2色谱条件的考察
3.2.1柱温的考察 分别考察了温度在30 ℃、35 ℃、40 ℃的指纹图谱。结果显示，当柱温在40 ℃时样品中3种成分的峰面积大于其余两种温度。
3.2.2检测波长的考察 本次试验对供试品做了全波长扫描，发现次野鸢尾黄素在204 nm处有最大的紫外吸收，其次是266 nm；五味子醇甲在216 nm处有紫外吸收，其次是252 nm；细辛脂素在202 nm处有最大的紫外吸收，其次是286 nm和236 nm纳米，见图4-图6。参照2015年版《中国药典》3种成分的最佳波长在266 nm，250 nm，287 nm，因此，将3个波长分别作为测试波长，结果发现细辛脂素在287 nm处峰面积远大于其余2个波长，而其余2个成分在3个波长峰面积下相差不多，后又发现细辛脂素在287 nm处峰形较其余两个波长处尖锐，这表明细辛脂素在266 nm和250 nm处可能有干扰，因此，最后选择287 nm作为最佳波长。
图4 次野鸢尾黄素的吸收光谱
图5 五味子醇甲的吸收光谱
图6 细辛脂素的吸收光谱
3.2.3 色谱柱考察 笔者考察了3种色谱柱：SHIMADZU-GL WondaCract ODS-2、Agilent Zorbax SB C18、SHIMADZU VP-ODS色谱柱，规格均为(250 mm×4.6 mm×5 μm)。结果显示SHIMADZU VP-ODS色谱柱所显示的图谱基线最平稳，细辛脂素峰与其后边的杂峰分离效果较好，更能稳定表达射干麻黄汤三种成分的含量测定。
3.3系统耐用性实验
将流动相系统的初始梯度进行微调，方法1将0～20 min的流动相比例变为20%～45%，其余条件不变，方法2将0～20 min的流动相比例变为40%～45%，其余条件不变。结果显示，初始梯度微调后各指标均有良好的分离度，且峰面积无较大差别，表明该方法系统耐用性良好。
3.4阴性样品实验
取“2.4”项下的3个供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，结果发现供试品1样品无次野鸢尾黄素峰显示，样品2无五味子醇甲峰显示，样品3无细辛脂素峰显示。由此可见，3种成分可以作为射干麻黄汤的质量控制指标。
4结论
本次研究建立了对射干麻黄汤中的3种成分同时进行含量测定的方法，其中，次野鸢尾黄素为黄酮类化合物，五味子醇甲和细辛脂素为木脂素类化合物[8-10]。3种成分同时测定，方法简便易行，精密度、重复性、稳定性、线性、加样回收率均符合规定，可以将次野鸢尾黄素、五味子醇甲、细心脂素作为射干麻黄汤中射干、五味子、细辛三味药材质量控制的方法。
