固相萃取高效液相色谱法快速测定玄参有效成分

何仕如，李 漓，许光明，赵 凡，肖美凤

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

玄参为玄参科玄参属植物玄参(ScropularianingpoensisHemsl)的干燥根，具有清热凉血、泻火解毒、滋阴的功效[1]。主要用于治疗热病伤阴、舌绛烦渴、温毒发斑、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉、痈肿疮毒等病症。在对玄参的各项研究中，已有许多方法对其进行含量测定，如传统的高效液相色谱法[2]、HPLC双波长切换法[3]、微波辅助萃取法[4]等，但这些方法对玄参的含量测定还局限于一种或者两种化合物，无法对药材和制剂达到真正有效控制。同时也因为中药的成分复杂、杂质较多的原因，难以达到有效成分的富集。而固相萃取法[5]作为从中药材样品中提取净化微量有效成分的新方法，已被用于诸多中药材样品的检测中，其中尤以与高效液相技术结合用于中药材样品指标性成分的分析引人注目[6-7]，但是在针对玄参指标成分的研究上还有很大的研究空间。

在研究中，利用固相萃取法提取玄参中5种指标成分(哈巴苷、哈巴俄苷、桃叶珊瑚苷、安格洛苷C、肉桂酸)，采用高效液相色谱法测定其含量，并通过与传统工艺方法的比较，比较传统工艺方法与固相萃取法之间的优劣。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

玄参药材，采自湖南省新邵县常春藤中药材种植基地，经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为玄参科植物玄参ScropularianingpoensisHemsl.的根茎；甲醇(色谱纯)购于国药集团化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)购于德国Merck公司；磷酸(色谱纯)购于川东化工集团；其余试剂均为分析纯。桃叶珊瑚苷(批号：K02N7B23963，纯度≥98%)，哈巴苷(批号：Y24O6H5019，纯度≥98%)，哈巴俄苷(批号：Y08D7H26552，纯度≥98%)，肉桂酸(批号：AA0807DA14，纯度≥98%)，安格洛苷C(批号：ZJ0619BB13，纯度≥98%)，均购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

岛津LC-20A型高效液相色谱仪(日本SHIMDAZU公司)；ODS C18(美国Agela Technologies 公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；GM-0.33隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)；WGL-125B电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.01%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序：0～5 min，5%～20%乙腈(A)；5～10 min，20%～25% 乙腈(A)；10～20 min，25%～33%乙腈(A)；20～25 min，33%～50%乙腈(A)；25～30 min，50%～80%乙腈(A)；30～35 min，80%～80% 乙腈(A)；35～40 min，80%～95%乙腈(A)；40～45 min，95%～5%乙腈(A)； 检测波长210 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸、安格洛苷C、桃叶珊瑚苷标准品2.5、2.2、1.4、2.5、12.5 mg，加适量50%甲醇溶解分别制成2.5、2.2、1.4、2.5、12.5 mg/mL的标准溶液，再分别配制成桃叶珊瑚苷1.25～320 μg/mL、哈巴苷7.25～960 μg/mL、安格洛苷C1.25～320 μg/mL、哈巴俄苷1.25～640 μg/mL和肉桂酸1.25～320 μg/mL的一系列浓度梯度的标准溶液。

2.3 供试品溶液的制备

传统方法：取玄参粉末(过50目筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，加塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

固相萃取法：取玄参粉末(过50目筛)0.01 g，精密称定，加入固相萃取小柱中，用1 mL 50%的甲醇溶液进行萃取，萃取温度保持在25 ℃，萃取30 min，过滤，收集续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察按“2.1”色谱条件，对“2.2”中玄参的一系列梯度的标准溶液进样分析，测定这一系列标准溶液的峰面积，以各化合物的质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并求出回归方程，见表1。标准品色谱见图1。

表1 对照品的线性方程

1.桃叶珊瑚苷；2.哈巴苷；3.安格洛苷C； 4.哈巴俄苷；5.肉桂酸

2.4.2 精密度试验 按本实验“2.3”固相萃取法进行样品的制备，取同一份玄参样品溶液20 μL，重复进样6次，以玄参中指标性成分的峰面积为考察指标，测定指标性成分峰面积值，算出指标成分的RSD值为2.7%，表明该实验有较好的精密度。

2.4.3 重复性试验 取同一批玄参药材6份，按本实验“2.3”固相萃取法平行进行提取，以高效液相色谱仪进样测定，求得玄参药材中指标性成分的RSD为1.9%，表明该方法重复性好。

2.4.4 稳定性试验 取玄参同一样品按本实验“2.3”固相萃取法提取的处理液，在配制后的0、2、4、8、12、24 h进样测定，求得指标成分峰面积的RSD值为2.3%，结果表明玄参中的目标化合物在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收试验 精密称取已知各目标化合物量的玄参粉末0.01 g，分别准确加入高中低3种(0.8、1.0、1.2)浓度混合对照品适量，按照供试品溶液制备固相萃取法处理9份，按“2.1”项色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率，结果见表2。结果目标成分平均加样回收率在95.0%～105.0%之间，RSD值均小于3%。

表2 加样回收试验结果

以上数据表明，该方法具有较好的精密度、稳定性和重现性，可用于玄参指标性成分的准确测定。

2.5 样品含量测定

按照“2.4”方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进行测定。传统方法下测得桃叶瑚珊苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸各质量分数分别为0.09%、0.29%、0.03%、0.05%、0.02%。固相萃取方法下桃叶瑚珊苷、哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸各指标性成分质量分数分别为0.37%、2.58%、0.15%、0.12%、0.22%。样品色谱见图2。

S1 传统方法处理下玄参样品；S2固相萃取法处理下玄参样品

3 讨论与小结

固相萃取法应用于玄参药材5种指标成分的提取，可以同时完成玄参样品的分离、纯化与富集，去除了玄参中其他杂质成分，大大地提高了检测灵敏度。相比较于传统方法对玄参含量的测定，固相萃取法更为快速，只需要少量溶剂就可以完成提取分离，节省溶剂，减少了样品的前处理过程，操作更为简便。从“2.5”含量测定的结果可以看出，固相萃取-高效液相色谱法测定的各指标成分的含量均高于传统方法，因此固相萃取法对玄参中各指标成分的提取率更高，在玄参的含量测定中较传统工艺更有优势。综上所述，可以得出固相萃取-高效液相色谱法测定玄参化学成分较传统方法灵敏、快速。