银杏雌株高黄酮种质定向筛选

郁万文，韩 晋，曹福亮, 2*，汪贵斌

(1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014)

近年来，银杏叶的开发应用价值远远超过银杏果，因此世界范围内掀起了叶用银杏种植及银杏叶开发应用研究的热潮[1]。目前从银杏叶提取物中分离的黄酮类化合物主要为黄酮醇及其苷类、双黄酮、儿茶素三类，其中黄酮醇及其苷类中的槲皮素、山柰素、异鼠李素是银杏叶制剂质量控制的主要指标之一，占黄酮类化合物的95%以上，能扩张血管、清除自由基、抗动脉硬化等，是治疗心脑血管疾病的主要有效成分[2]。高产优质银杏叶原料的生产受到银杏叶生长、采收和加工过程中诸多因素的影响，包括品种、性别、树龄、产地、采收时期等[2-10]。中国拥有大量的银杏资源，积极开展叶用银杏种质资源研究，选育并推广有效成分含量高且稳定的种质，是叶用银杏种植中亟待解决的问题[2-3]。选育叶用银杏良种时，多数学者认为应首先考虑叶中黄酮和萜内酯含量，其次才是产量[3,11]。银杏叶中黄酮含量在很大程度上受基因控制[2,12]，即种质是影响银杏叶中有效成分量的重要因素之一，甚至是决定黄酮含量的关键因素。另外，叶中黄酮和萜内酯含量和产量又受到生育期、采收时间的显著影响，如4月是叶中总黄酮含量最高的月份[13]，但叶产量小；秋季叶尚绿时( 8～10月) 总黄酮含量较低，但叶产量大[14]。对于何时采收合适，说法不一，从 4 月到 11 月，都有可作适采期的结论[2]。本研究以筛选春茶用和黄酮提取用的叶用种质为目的，开展了生育前期和生育后期叶中高黄酮含量雌株种质的定向和联合筛选，以期为春茶用和黄酮提取用叶用银杏的定向培育提供种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

参照陈学森等、江德安等的研究结果[14-15]，对南京林业大学于2002、2005年引种的2批银杏中雌株进行了连续两年的物候观察和标准枝上叶形态及产量统计，初选出了46株叶大而厚，叶量大的雌株。参照林琰等的研究结果[16]及赵学农等制茶采摘时间[17]，分别于2018年9月上旬、2019年4月上旬采集供试的28个单株的向阳树冠外围叶片，装于信封中，于105℃烘箱内杀青15 min，60℃烘至恒重，粉碎过筛后备用。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶提取液制备

参考《中国药典》中银杏叶黄酮提取方法，略有改动[18]。称取粉碎后的叶粉1.000 g，包于直径12.5 cm的脱脂滤纸中，并用脱脂棉线捆绑成柱状的滤纸包。先用100 mL的石油醚于80℃水浴条件下在索氏提取器中对装有银杏叶粉的滤纸包除杂2.5 h，取出后于60℃烘箱中烘至恒重。再将除杂后的滤纸包用100 mL的分析纯甲醇于80℃水浴条件下索氏提取4.5 h。减压浓缩后，残渣用色谱甲醇和25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，加热回流30 min，放冷，转移至50 mL容量瓶用色谱甲醇定容至刻度，摇匀即得供试样品制备液。每个样品重复3次。过0.22 μm有机微孔滤膜，滤液供HPLC测定。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×150 cm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸溶液(54∶46)；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：40℃；进样量：10 μL。

总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰酚含量+异鼠李素含量)×2.51

以黄酮苷元(槲皮素、山奈酚、异鼠李素)对照品浓度X(mg/L)为横坐标，峰面积为Y为纵坐标，绘制标准曲线，得到如下线性回归方程(表1)。

黄酮标准品溶液的高效液相色谱图如图1所示。

表1 银杏黄酮标准品的线性回归方程

1.3 数据处理方法

采用DPS7.04和Excel 2016统计分析软件对试验数据进行处理和方差分析，运用Turky法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 生育初期银杏雌株叶中黄酮含量差异分析

生育初期银杏雌株叶中黄酮含量见表2。由该表可知，生育初期的银杏雌株叶中黄酮3个主要组分含量两两差异极显著，且山奈酚>槲皮素>异鼠李素。方差分析表明，各银杏雌株间的叶中总黄酮及3个主要组分含量均差异极显著(P<0.01)，且存在较大变异，变异系数范围为21.06%～33.35%，表现为CV异鼠李素>CV槲皮素>CV山奈酚>CV总黄酮。供试雌株生育前期叶中槲皮素含量变幅为0.933～3.120 mg/g，含量高于均值2.013 mg/g的单株有22个，分别为42、30、46、48、47、44、45、19、43、51、50、32、33、49、29、13、35、16、36、11、9、15；山奈酚含量变幅为1.767～5.747 mg/g，含量高于均值3.534 mg/g的单株有21个，分别为48、41、15、17、50、49、21、45、38、43、39、30、29、18、9、47、37、46、35、51、27；异鼠李素含量变幅为0.855～2.717 mg/g，含量高于均值1.669 mg/g的单株有25 个，分别为43、46、29、50、44、49、42、30、37、26、47、48、33、32、36、51、21、45、27、15、35、17、56、9、20；总黄酮含量变幅为10.173～26.653 mg/g，含量高于均值18.111 mg/g的单株有20个，分别为48、50、46、30、43、49、15、29、42、47、45、44、21、51、17、37、9、35、18、32。参照李卫星等的方法[19]，设定某单株槲皮素、山奈酚、异鼠李素、总黄酮含量均高于所有供试单株的均值作为叶用株系入选标准，共有12单株入选，分别是9、15、29、30、43、45、46、47、48、49、50、51。

表2 生育初期银杏雌株叶中黄酮及其组分含量

续表2 生育初期银杏雌株叶中黄酮及其组分含量

注：表中同列不同小写英文字母表示在5%水平上差异显著；同行不同大写英文字母表示在1%水平上差异显著。

2.2 生育后期银杏雌株叶中黄酮含量差异分析

生育后期银杏雌株叶中黄酮含量见表3。由该表可知，生育后期的银杏雌株叶中槲皮素与山奈酚含量差异不显著(P>0.05)，但两者均极显著高于异鼠李素(P<0.01)。方差分析表明，单株间的叶中总黄酮及3个主要组分含量均存在极显著性差异(P<0.01)，且存在较大变异，变异系数范围为29.11%～50.13%，表现为CV槲皮素>CV异鼠李素>CV总黄酮>CV山奈酚。供试雌株生育后期叶中槲皮素含量变幅为0.344～2.066 mg/g，含量高于均值0.873 mg/g的单株有17个，分别为42、46、47、44、45、19、50、29、43、48、33、34、56、30、32、49、13；山奈酚含量的变幅为0.389～1.515 mg/g，含量高于均值0.848 mg/g的单株有23个，分别为48、41、46、45、42、43、47、56、50、17、15、39、44、29、33、38、51、9、25、21、49、13、55；异鼠李素含量的变幅为0.187～1.086 mg/g，含量高于均值0.485 mg/g的单株有18个，分别为46、44、50、42、43、47、29、34、45、16、51、56、33、48、20、49、30、13；总黄酮含量的变幅为2.412～10.876 mg/g，含量高于均值5.537 mg/g的单株有18个，分别为46、42、47、44、45、50、43、48、29、19、56、33、34、51、16、49、30、13。进一步设定某单株槲皮素、山奈酚、异鼠李素、总黄酮含量均高于所有供试单株的均值作为叶用株系入选标准，共有11个单株入选，分别是29、33、42、43、44、45、46、47、48、50、56。

表3 生育后期银杏雌株叶中黄酮及其组分含量

续表3 生育后期银杏雌株叶中黄酮及其组分含量

注：表中同列不同小写英文字母表示在5%水平上差异显著；同行不同大写英文字母表示在1%水平上差异显著。

2.3 生育前期和生育后期银杏叶中黄酮及其组分含量相关性

生育初期和生育后期银杏雌株叶中黄酮含量及其组分含量相关性见表4。由该表可知，生育前期和生育后期的叶中总黄酮含量分别与各自时期的槲皮素、山奈酚、异鼠李素3个组分含量均达到极显著高度正相关(P<0.01)；生育前期的叶中异鼠李素含量与槲皮素呈极显著高度正相关，与山奈酚呈极显著中度正相关，山奈酚与槲皮素相关性不显著；生育后期的叶中异鼠李素含量与槲皮素呈极显著高度正相关，山奈酚与异鼠李素、槲皮素呈极显著中度正相关。值得注意的是，生育前期和生育后期间叶中总黄酮及其组分的含量均呈极显著的高度正相关(R槲皮素=0.85**，R山奈酚=0.73**，R异鼠李素=0.76**，R总黄酮=0.72**)，这为开展两个生育期高黄酮种质资源的联合筛选提供了数据支撑。

表4 两个生育期银杏雄株叶中总黄酮及其组分含量相关性

注：*p<0.05，**p<0.01

2.3 银杏雌株种质定向筛选

2.3.1 以银杏茶为目标的叶用银杏雌株种质筛选

以46个银杏雌株生育前期叶中总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量利用DPS软件采用欧式距离和类平均法(UPGMA)进行聚类。根据距离系数的大小，结合图2中明显的聚类特征，如图2和表5所示，将所有单株分成了3类。第Ⅰ类，包含8个单株，表现为总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量为3类中最低；第Ⅱ类，包含26个单株，其叶中总黄酮及山奈酚、异鼠李素含量处于中等水平，介于第Ⅰ类和第Ⅲ类之间；第Ⅲ类包含12个单株，其叶中总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量均较高。所以，上述第Ⅲ类(15、29、30、42、43、44、45、46、47、48、49、50)可作为用于开发银杏春茶的叶用种质进行区试或推广。

表5 基于生育前期叶中总黄酮及其组分含量的雌株分类

图2 基于生育前期叶中总黄酮及组分含量的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of total flavonoids and their components in leaves at early growth stage

2.3.2 以银杏黄酮提取为目标的叶用银杏种质筛选

以46个银杏雌株生育后期叶中总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量利用DPS软件采用欧式距离和类平均法(UPGMA)进行聚类。根据距离系数的大小，结合图3中明显的聚类特征，如图3和表6所示，将所有单株分成了4类。第Ⅰ类，包含16个单株，表现为总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量均值为4类中最低；第Ⅱ类，包含22个单株，其叶中总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量均值仅高于第Ⅰ类；第Ⅲ类包括6个，其叶中总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量仅低于第Ⅳ类；第Ⅳ类包含2个单株，表现为总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量均值为4类最高。综上所述，用于黄酮提取的叶用银杏种质进行区试或推广时应首选第Ⅳ类(42、46)，第Ⅲ类(43、44、45、47、48、50)次之。

表6 基于生育后期叶中总黄酮及其组分含量的雌株分类

2.3.3 兼用型叶用银杏种质筛选

以46个银杏雌株生育前期和生育后期叶中的总黄酮含量利用DPS软件采用欧式距离和类平均法(UPGMA)进行聚类。根据距离系数的大小，结合图4的聚类特征，如图4和表7所示，同时为筛选出两个生育期叶中总黄酮含量均高的单株，将所有单株细分成了6类。第Ⅰ类，仅含1个单株，表现为两个生育期叶中总黄酮含量为6类中最低；第Ⅱ类，包含11个单株，其两个生育期叶中总黄酮含量均值仅高于第Ⅰ类；第Ⅲ类包含22个单株，其两个生育期叶中总黄酮含量仅高于第Ⅰ、Ⅱ类；第Ⅳ类包含3个单株，生育前期叶中总黄酮含量较高，而生育后期的总黄酮含量中等；第Ⅴ类包含8个单株，第Ⅵ类包含1个单株，这两类在生育前期和后期的总黄酮含量均较高。所以，上述第Ⅴ类(29、42、43、44、45、46、47、50)和第Ⅵ类(48)，可作为银杏春茶及黄酮提取的兼用型叶用银杏种质进行区试或推广。

图3 基于生育后期叶中总黄酮及组分含量的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of total flavonoids and components in leaves at late growth stage

3 结论与讨论

近年研究表明，有关高黄酮含量的春茶用和黄酮提取用银杏专用和兼用种质选育研究滞后，为提高银杏春茶中黄酮含量及黄酮提取效率，增加银杏资源附加值，开展高黄酮含量的专用和兼用种质选育，对银杏春茶和黄酮提取的研制生产和市场开发意义重大。

本研究表明，生育初期的银杏雌株叶中黄酮组分含量差异极显著，且山奈酚>槲皮素>异鼠李素；生育后期的叶中槲皮素与山奈酚含量差异不显著，但两者均显著高于异鼠李素。上述结果说明，不同生育期叶中黄酮组分的含量和比例发生变化，且生育初期的黄酮及其组分含量显著高于生育后期，相差1.31～3.17倍。各银杏雌株间的叶中总黄酮及各组分含量均存在显著差异和较大的变异系数，与戴余军等[7]、王弘等[20]、刘叔倩等[8]的研究结果一致，这为开展叶用银杏种质的筛选提供了物质基础和数据支撑。参照李卫星等的方法[19]，设定某单株槲皮素、山奈酚、异鼠李素、总黄酮含量均高于所有供试单株的均值作为叶用单株入选标准，基于生育前期的黄酮及组分含量入选的单株有12个，分别是9、15、29、30、43、45、46、47、48、49、50、51；基于生育后期的黄酮及组分含量共有11个单株入选，分别是29、33、42、43、44、45、46、47、48、50、56。

图4 基于生育前期和生育后期叶中总黄酮含量的聚类分析Fig.4 Cluster analysis of total flavonoids in leaves of early and late growth stages

表7 基于生育前期和后期的叶中总黄酮含量的单株分类

银杏叶提取物中的黄酮类化合物主要为黄酮醇及其苷类、双黄酮、儿茶素三类，其中黄酮醇及其苷类中的槲皮素、山奈酚、异鼠李素是银杏叶制剂质量控制的主要指标之一，占黄酮类化合物的95%以上[2]。研究表明，生育前期和生育后期的叶中总黄酮含量分别与各自生育时期的槲皮素、山奈酚、异鼠李素3个组分含量均呈极显著高度正相关，是合乎常理的，因为总黄酮含量是各种组分含量的总和，每种组分的增减必然引起总黄酮含量的增减。通过3个主要组分相关性分析发现，生育前期和生育后期的叶中异鼠李素含量与槲皮素呈极显著高度正相关，这种相关关系是我们所期望的，可能与合成路径中的黄酮组分受相同关键酶或合成前提物的调控有关；而生育前期叶中山奈酚与槲皮素相关性不显著，但生育后期叶中山奈酚与槲皮素呈极显著中度正相关，造成上述相关关系的原因可能有两种，其一可能与来自不同合成支路的黄酮组分受各自关键酶的调控有关，其二可能是不同发育时期叶中黄酮代谢对特定发育时期的生理响应。值得注意的是，生育前期和生育后期间叶中总黄酮及其组分的含量均呈极显著的高度正相关，这为开展两个生育期高黄酮种质资源的联合筛选提供了数据支撑。

关于银杏叶用品种的选择还没有规范系统的标准，现在大部分的叶用选择标准，一般是以叶形态指标、产叶量、有效成分黄酮和萜内酯含量等来筛选优质叶用种质。在确定叶用银杏品种定向选择目标和标准时，首先需考虑叶中药用有效成分含量，其次才是产量性状[14]，春茶用、黄酮提取用及兼用型银杏种质的筛选也是如此。笔者基于46 个银杏单株生育前期叶中的总黄酮及槲皮素、山奈酚、异鼠李素3个组分含量的聚类分析，筛选出了12个叶中黄酮及组分含量均较高的单株，即15、29、30、42、43、44、45、46、47、49、50、48，可作为制备银杏春茶用种质进行区试或推广；基于生育后期叶中总黄酮及3个主要组分含量的聚类分析，筛选出了8个叶中黄酮及组分含量均较高的单株，分别是42、46、43、44、45、47、48、50，可作为黄酮提取用银杏种质进行区试或推广；基于生育前期和生育后期叶中总黄酮含量的聚类分析，筛选出了9个在生育前期和生育后期叶中黄酮均较高的单株，分别是29、42、43、44、45、46、47、50、48，可作为银杏春茶及黄酮提取的兼用型叶用银杏种质进行区试或推广。