正交试验优化黑果枸杞果实中花青素的提取工艺

2020-04-10孔东升刘睿明

中国野生植物资源 2020年2期

贺盼，孔东升，2，3*，王立，刘睿明

(1.甘肃农业大学林学院，甘肃兰州 730070；2.河西学院，甘肃张掖 734000；3.甘肃省黑果枸杞工程研究中心河西学院，甘肃张掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生耐盐、抗旱的灌木植物，黑果枸杞浆果呈球形，成熟后为紫黑色、无毒、有甜味，是一种有待开发的野生植物资源[1]。黑果枸杞主要分布于我国宁夏、甘肃、青海、内蒙古、新疆、西藏及陕西北部黄土高原[2]，而在甘肃则主要分布于河西走廊地区[3]。黑果枸杞果实具有强肾、润肺、明目、健胃、补脑、抗衰老及通经作用[4]，是一种药食同源的保健食品[5]，果实中含有丰富的人体必需酚类物质、维生素、蛋白质以及氨基酸，还含有丰富的常量及微量元素[6]，尤其是含有丰富花色苷，被称为“花青素之王”。花青素又称“花色素”，是一种水溶性的天然植物色素，安全无毒，属于黄酮类化合物[7-8]，存在于植物的花、根、叶、果及种皮等部位的细胞液泡中[9]，具有抗发炎、降血糖、护肝等诸多药理作用[10-13]，有较强的抗氧化、抗自由基以及抗衰老等功能[14-15]。近年来随着人们对食品安全和自身健康的日益重视，红花(Carthamustinctorius)红色素、萝卜(Raphanussativus)红等多种天然色素已被我国卫生部批准用于饮料、乳制品和糕点中，花青素作为一种多功能天然色素，它的提取和应用也受到越来越多的关注[16]。

目前，提取花青素的方法有水溶液提取法[17]、有机溶剂提取法[18]、超声波辅助提取法[19]、微波辅助提取法[20]及微生物发酵提取法[21]等。其中，水溶剂提取法最简单易行，但对花青素的提取效率极低，而超声波辅助、微波辅助及微生物辅助法等方法多需要特定设备且成本偏高。有机溶剂提取法已被证实适用于黑果枸杞色素提取，且具有简单、高效、无毒的优点。李进等[22]对新疆黑果枸杞色素提取的研究中确定pH 3.0的80%乙醇作浸提剂、提取温度50℃、提取时间3 h、固液配比1:40为最佳提取条件；刘翔等[23]也利用有机溶剂提取法对新疆黑果枸杞花青素含量进行测定，结果表明70%的1%酸性乙醇、固液比为1:20、置于暗处常温浸提4 d为最佳条件；然而，在刘振华[24]对青海黑果枸杞花青素含量的研究中则认为用70%浓度的乙醇、物料比为1:13、提取温度为55℃、提取2.5 h为最佳条件。不同来源的黑果枸杞的花青素含量各异，提取参数的不同，提取率结果也不一样[22-24]。河西走廊具有特殊的气候，而且人工栽培的黑果枸杞有成熟期集中、水肥条件好、管理精细等特点，所需要提取的参数可能不同。尤其是花青素是一种具有较强极性的水溶性天然色素，当试验中花青素含量与乙醇浓度二者的极性达到一致时花青素的溶出将达到最大值，就会导致物料比、温度、时间参数的相应变化，因此，许多学者[23]测定了不同种源的野生黑果枸杞花青素，可能导致不同种源花青素的提取用同一种参数时，提取率不一定都达到极值而无法比较，更没有对特定的同一地区人工栽培条件下的花青素提取参数进行研究。因此，本试验对玉门市人工栽培黑果枸杞果实采用有机溶剂提取的方法，并通过正交试验进行优化确定最佳提取条件，并确定是否需要脱脂，为后期河西走廊地区黑果枸杞优良品种的选育和深加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞果实：于2018年8月初采自甘肃省玉门市花海镇、小金湾乡、独山子乡人工栽培的黑果枸杞。

试剂：香草醛(天津市光复精细化工研究所)、矢车菊-3-O-葡萄糖苷(四川省维克奇生物科技有限公司)、无水乙醇、石油醚(30～60℃)、盐酸、硫酸均为分析纯、甲醇为色谱纯。

1.2 仪器与设备

电子天平、粉碎机、60目筛、鼓风干燥箱、恒温水浴锅(型号DK-98-Ⅱ天津市泰斯特仪器有限公司)、索氏提取器、离心机(型号3H12RI 湖南赫西仪器装备有限公司)、pH计(赛多利斯科学仪器有限公司)、紫外可见分光光度计(型号UV-1701PC)。

1.3 方法

1.3.1 材料的预处理

对黑果枸杞果实进行干燥处理，并剔除破碎果实与果梗后粉碎，过60目筛。

1.3.2 花青素标准曲线建立

精密称取10 mg矢车菊-3-O-葡萄糖苷对照品配成1 mg/mL的溶液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL用硫酸香草醛法进行吸光度测定，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得回归方程y=0.1545x+0.0135，R2=0.9828，其浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

1.3.3 花青素含量测定方法

将提取的花青素液置于分光光度计中，在黑果枸杞色素乙醇溶液最大吸收波长(545 nm)条件下[27]测定吸光度三次，并取平均值。根据比尔定律可知，吸光度与色素浓度成正比，可直接用吸光度表示色素浓度或含量大小[26]。采用硫酸-香草醛法[27]测定花青素含量，其计算公式为﹕

式中，Ax为供试品溶液吸光度，Cr为对照品溶液浓度，Ar为对照品溶液吸光度，D为稀释倍数，W为供试品质量。

1.3.4 花青素提取的单因素试验

分别对pH值3.0的盐酸-乙醇浓度、物料比、提取时间、提取温度4个因素进行单因素试验，提取剂pH值3.0的盐酸-乙醇的浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；物料比分别为 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50；提取时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h；提取温度分别为 30、40、50、60、70、80℃，然后在转速8000 r/min离心10 min提取上清液，加入2.5 mL 30%的硫酸溶液摇匀，再加入25 mL 1%的香草醛溶液，避光作用30 min，在分光光度计中测其吸光度，根据标准曲线计算花青素含量。各试验设置三重复。

1.3.5 正交设计试验

以提取溶剂浓度(A)物料比(B)提取时间(C)提取温度(D)四个因素3个水平进行正交试验设计(表1、表2)，以花青素提取率为指标，优化提取花青素的最佳参数。

表1 试验因素与水平

1.3.6 脱脂处理

准确称10 g黑果枸杞果实粉末与石油醚按照1∶10(g∶ml)混合置于索氏提取器中，于50℃水浴中回流提取3 h后，取出黑果枸杞粉末置于通风阴凉处待其干燥后用于花青素提取。提取条件为pH值3.0的80%的盐酸-乙醇、物料比为1∶15、提取时间为5 h、提取温度为40℃进行花青素的提取，重复三次试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取剂浓度对黑果枸杞花青素提取率的影响

花青素是一种具有较强极性的水溶性天然色素，在亲水性有机溶剂中乙醇的极性最大，随着乙醇浓度增大其极性也增大，当两者的极性达到一致时花青素的溶出将达到最大值，而后乙醇浓度的增大使得其极性偏离了花青素的极性[28]。如图1所示，随着乙醇浓度从20%上升到70%时，花青素的提取率也逐渐升高，并且在乙醇浓度达到70 %时，花青素提取率也达到了最大；而乙醇浓度从70%上升到100%时花青素的提取率则呈现下降趋势，因此，选择浓度为pH值3.0的70%的盐酸-乙醇为花青素提取的溶剂浓度。

2.1.2 物料比对黑果枸杞花青素提取率的影响

随着加入提取剂体积的增大，其与枸杞果实粉末的接触面积也在增大，更有利于花青素的溶出。但当达到反应饱和状态后，提取剂的增加反而会溶出一些杂质而影响花青素的提取率。如图2所示，物料比在1∶15时花青素的提取达到了最高点，在1∶20之后处于下降趋势，因此选择1∶15为花青素提取的最佳物料比。

图1 乙醇浓度对花青素提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

图2 物料比对花青素提取率的影响Fig. 2 Effect of material ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 提取时间对黑果枸杞花青素提取率的影响

花青素是一种不稳定的物质，易受到光照、氧气等影响，所以提取花青素的时间是一个相当重要的因素。如图3所示，随着时间从1 h上升至6 h，花青素的提取量也在上升并在6 h达到最高点，6 h之后花青素的提取量逐渐下降并趋于平稳，因此，选择6 h为适宜提取时间。

2.1.4 提取温度对黑果枸杞花青素提取率的影响

花青素对高温非常敏感，研究发现温度越高花青素降解的速度越快[30]。如图4所示，温度从30℃上升至50℃，花青素的提取率也在上升，并在50℃达到最高点，提取率为0.868%，在60℃到80℃随着温度上升花青素的提取率逐渐下降，因此选择50℃为花青素的适宜提取温度。

图3 提取时间对花青素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of anthocyanin

图4 提取温度对花青素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of anthocyanin

2.2 正交试验结果与分析

表2 正交试验结果

通过正交试验表2可以直观的看出提取溶液浓度、时间、温度及物料比四个影响因子中，提取时间(C)>提取温度(D)>溶液浓度(A)>物料比(B)。所以，可以确定最优组合为A3B2C1D1即80%的pH值3.0的盐酸-乙醇、物料比为1∶15、提取时间为5 h、提取温度为40℃。

2.3 脱脂对花青素提取率的影响

表3 黑果枸杞花青素提取结果

如表3所示，脱脂处理会明显降低黑果枸杞花青素的提取率，比未脱脂果枸杞花青素提取率低了0.248%。这可能是石油醚脱脂的过程中脱掉了部分以单体形式存在的色素，从而导致其含量降低，也可能脱脂处理使黑果枸杞在空气中暴露时间延长，使得花青素被氧化。

3 讨论

3.1 试验参数的确定

正交试验得到的参数与单因素试验结果有差异，表明多个因素相互作用影响了黑果枸杞花青素的提取率。正交试验结果显示,提取时间及提取温度对其提取率影响最大，其次才是溶液浓度和物料比。正交试验最优提取物料比与单因素保持一致，但相对于单因素试验结果而言，其提取时间相应缩短了，而提取液浓度增大了，这是由于花青素的双苯环结构有很强的的极性，适当的增加提取液浓度使两者极性达到一致，能够促使花青素更快的溶出；高温会加快花青素苷的降解，因此适当的降低温度会减缓花青素的降解从而提高提取率[29]。但进一步降低pH值是否会提高花青素提取率，还需要进一步研究。

3.1 试验结果讨论

本试验利用有机溶剂提取法，经过单因素试验和正交试验的优化，最终测得黑果枸杞花青素含量均值为0.978%，脱脂后的花青素含量均值为0.730%，未脱脂的黑果枸杞果实花青素提取率明显高于脱脂。虽然花青素提取方法的研究较多，但针对黑果枸杞的研究甚少尤其是河西走廊黑果枸杞，相同提取方法中，刘振华[27]测得市售和果枸杞花青素含量为0.424%；汪洋[29]测得青海、新疆、内蒙、北京等地的黑果枸杞未脱脂花青素含量范围为0.069%～0.84%，但不同提取参数，本试验所测结果稍优于其他地区，可能是由于本试验所测黑果枸杞为人工栽培，其施肥、浇水等因素，使黑果枸杞果实优于野生，导致本试验所测花青素高的原因；也可能是河西走廊地区特殊地理环境更适宜黑果枸杞积累更多的花青素。祁银燕[24]等利用超声辅助提取法测得柴达木野生和人工栽植黑果枸杞花青素含量分别为0.837%和0.897%，虽然超声辅助提取比有机溶剂提取节省时间，但结果不相上下，并且有机溶剂提取更适用于后期大量黑果枸杞优树选择的实验室测定工作，而超声辅助更适用于产业化花青素提取。