梭鱼草对铜胁迫的光合适应性1)

马思思 辛建攀 田如男

(南京林业大学，南京，210037)

铜离子(Cu2+)是植物生长发育必需的微量营养元素之一[1]，广泛分布在植物细胞内多种酶的活性中心，参与光合作用、呼吸作用、碳水化合物代谢、氮代谢、细胞壁合成和激素信号传递等多项生理生化代谢过程[2]。Cu2+在光合电子传递过程中承担着重要作用[3]，PSI的电子先传递给质体蓝素(铜蛋白)，通过Cu2+化合价的变化，再将电子传递到PSII[4]。研究表明，低质量浓度Cu2+可提高植物叶片叶绿素、类胡萝卜素质量分数及PSII的综合活性，进而提高光能转化效率和光合速率，促进植物生长[5]。但是，由于多数植物体内金属平衡网络缺乏应对高质量浓度重金属离子的能力，植物会遭遇高质量浓度重金属离子的毒害作用[6]，当生长介质中Cu2+质量浓度超过一定范围时，植物细胞中会积累过量的过氧化氢、羟基自由基、单线态氧等活性氧自由基，对光合系统(如叶绿体结构、D1蛋白质)造成一定的破坏作用，从而不利于叶片光合代谢过程[7]。

梭鱼草(Pontederiacordata)为雨久花科(Pontederiaceae)梭鱼草属(Pontederia)多年生大型挺水植物，植株高大，顶生穗状花序，小花蓝紫色，园林观赏价值较高，是湿地重建和恢复、城市景观水体绿化的良好材料[8]；其根系发达，生物量大，在重金属污染环境修复中具有较大潜力，以往有学者对梭鱼草去除重金属铜的效率进行比较分析，发现当初始Cu溶解态质量浓度为1.804 mg·L-1时，修复30d后，梭鱼草对Cu2+质量浓度的去除率为58%，表明梭鱼草对Cu2+具有一定的富集能力[9]。植物光合作用是植物各种代谢活动中对环境因子最敏感的生理过程之一，可以用来判断植物对重金属污染环境的适应能力[10]。陆奇杰等[11]研究发现，Cu2+质量浓度的增加会使植物叶片叶绿素质量分数和Pn、Gs下降速度急剧加快。张文斌等[12]研究了不同Cu2+质量浓度下水葫芦叶片初始荧光、光化学淬灭系数和光合电子传递量子效率显著下降。可见，重金属胁迫会对植物光合系统产生严重的影响。本研究采用液培法，研究了不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片光合色素质量分数、光合生理学参数及叶绿素荧光参数的影响，以探究梭鱼草叶片光合机构对Cu2+的适应能力，为梭鱼草在Cu2+污染水体生态修复中的应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料及处理

试验于南京林业大学国家级园林实验示范教学中心温室进行。供试的梭鱼草采购于杭州市天景水生植物园。于2018年4月份，在池塘水中培养，待植株高40～50 cm时，选取长势一致，生长状况良好的植株，置于1/2 Hoagland营养液中适应性培养20 d后用于试验。

试验采用水培的方法，培养液采用1/2 Hoagland营养液配制重金属处理液，试剂以分析纯CuSO4·5H2O配制，Cu2+质量浓度梯度设置为0、5、10、20 mg·L-1(以纯Cu2+计算)，分别为GB 3838—2002国家地表水环境质量标准中V类水的0、5、10、20倍，处理组分别以T1、T2、T3表示，对照组用CK表示。处理时，每个小桶加入2 L重金属处理液，每桶1株植物，试验期间定期补充蒸馏水至初始体积。每个处理10株，重复3次。

1.2 测定方法

1.2.1 叶片光合色素质量分数测定

参考李合生[13]的方法，并略加修改，用去离子水将叶片清洗干净，用滤纸吸干，去除主脉，剪碎混匀，称取0.2 g，共3份，置于20 mL的试管中，加入15 mL 95%乙醇，避光浸泡24 h，至组织变白无绿色，期间振荡试管使萃取液颜色均匀。以95%乙醇为空白对照，在波长665、649、470 nm下测定提取液吸光值。

1.2.2 光合气体交换参数的测定

铜处理5 d后，于晴朗无云的09:00—11:30选取植株上部功能叶片，采用英国PP-Systems便携式光合测定仪(CIRAS-2)测定各气体交换参数，包括叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)、饱间CO2摩尔分数(Ci)、叶面饱和蒸气压亏缺(VP，D)等。气孔限制值(Ls)按照吴克宁等[14]的计算方法：Ls=1-Ci/Cr(Cr为大气CO2质量浓度)，水分利用效率(WU，E)按照张正斌[15]的计算方法：WU，E=Pn/E。测定控制光合有效辐射参数(PA，R)为1 000 μmol·m-2·s-1，叶室温度25 ℃，CO2摩尔分数为380～420 μmol·mol-1。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定

铜处理5 d后，于晴朗无云的09:00—11:30，选取与测定气体交换参数相同的功能叶片测定叶绿素荧光参数。测定前先将叶片暗适应20 min，然后利用连续激发式荧光仪(Handy PEA)测定各处理梭鱼草叶片叶绿素荧光参数，包括暗适应状态的最大荧光(Fm)、可变荧光产量(Fv)、潜在光合活性(Fv/Fo)、PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、光合性能指数(PI，a，b，s)、反应中心净关闭速率(dV，G/dt，o和dV/dt，o)、单位面积吸收的光能(AB，S/CS，o)、单位面积捕获的光能(TR，o/CS，o)、单位面积电子传递的量子产额(ET，o/CS，o)、单位面积的热耗散(DI，o/CS，o)等。

1.3 数据处理

采用SPSS 24.0统计软件对数据进行单因素方差分析，并用Duncan新复极差法检验差异显著性(P<0.05，P<0.01)。采用Excel 2003软件进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片光合色素质量分数的影响

由表1可知，5 mg·L-1Cu2+处理下，梭鱼草叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总质量分数与CK无明显差异，表明梭鱼草叶片叶绿素对较低质量浓度Cu2+具有较强的耐受性。随溶液中Cu2+质量浓度的继续增加，梭鱼草叶片叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总质量分数呈下降趋势，其质量分数比CK分别下降了17.43%～43.65%、19.85%～42.14%和31.30%～43.24%。在5～20 mg·L-1Cu2+处理下，梭鱼草叶片类胡萝卜素质量分数呈先上升后下降趋势。当溶液中Cu2+质量浓度为5 mg·L-1时，叶片类胡萝卜素质量分数比CK增加了13.2%，这有利于保护叶绿素免遭活性氧自由基的破坏；当溶液中Cu2+质量浓度为10、20 mg·L-1时，叶片类胡萝卜素质量分数比CK分别下降了17.03%、31.30%。

表1 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片光合色素质量分数的影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片气体交换参数的影响

如表2所示，随溶液中质量浓度Cu2+的增加，梭鱼草叶片Pn、E、Gs和WU，E均呈下降趋势。经不同质量浓度Cu2+处理5 d时，梭鱼草叶片Pn、E、Gs比CK分别降低了43.77%～63.56%、61.85%～77.12%和70.07%～85.29%，而叶片Ci、Ls无明显变化，表明非气孔因素是Cu2+处理下梭鱼草叶片Pn下降的主要原因。与CK相比，经5～20 mg·L-1Cu2+处理5 d时，梭鱼草叶片WU，E降低了40.00%～52.31%，叶片蒸气压亏缺(VP，D)则表现出相反的变化趋势，表明Cu2+质量浓度对梭鱼草叶片水分代谢活动产生了不利影响。

表2 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片气体交换参数的影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片叶绿素荧光参数的影响

2.3.1对梭鱼草叶绿素荧光参数Fm、Fv和Fv/Fo的影响

Fm为暗适应下的最大荧光强度，反映通过光系统Ⅱ(PSⅡ)的电子传递情况。Fv为最大可变荧光强度，表征参与PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，反映了PSⅡ原初电子受体QA的还原情况。随着溶液中Cu2+质量浓度的增加，梭鱼草叶片Fm、Fv均呈下降趋势(表3)。与CK相比，经5、10 mg·L-1Cu2+处理5 d，叶片Fm、Fv无明显变化；25 mg·L-1Cu2+处理导致Fm下降48.30%，表明高质量浓度Cu2+导致梭鱼草叶片PSⅡ反应中心电子传递受阻。同时，当溶液中Cu2+质量浓度最高时，梭鱼草叶片Fv、Fv/Fo(PSⅡ潜在光合活性)比CK分别下降了59.93%、61.62%，表明高质量浓度Cu2+降低了梭鱼草叶片PSⅡ潜在光合活性，导致光合机构光能利用率下降[16]。

2.3.2对梭鱼草叶片PI，a，b，s和Fv/Fm的影响

PI，a，b，s是以吸收光能为基础的性能指数，可以反映植物叶片PSⅡ的功能和结构的总体状况。随溶液中Cu2+质量浓度的增加，梭鱼草叶片PI，a，b，s总体呈下降趋势(表3)。与CK相比，经5～25 mg·L-1Cu2+处理5 d时，叶片PI，a，b，s降低了51.16%～87.44%，表明Cu2+破坏了梭鱼草叶片PSⅡ反应中心的功能和结构。Fv/Fm为PSⅡ反应中心最大光化学量子产量，是反映PSⅡ原初光能转化效率的重要指标。梭鱼草植株在25 mg·L-1Cu2+处理下，叶片Fv/Fm比CK降低了24.39%，表明较高质量浓度Cu2+会导致梭鱼草叶片光合作用产生光抑制，从而降低光合机构的光能转化效率。

表3 不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片叶绿素荧光参数的影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3.3 对梭鱼草叶片反应中心关闭净速率的影响

dV，G/dt，o和dV/dt，o能够反映植物叶片PSII反应中心关闭的净速率。如表3所示，不同质量浓度铜处理下梭鱼草叶片反应中心净关闭速率(dV，G/dt，o和dV/dt，o)呈升高趋势。与CK相比，在5 mg·L-1和10 mg·L-1处理下叶片dV，G/dt，o和dV/dt，o无显著变化，在25 mg·L-1处理下叶片dV，G/dt，o和dV/dt，o与CK相比差异极显著，分别是对照的2.46倍和1.11倍，表明较高质量浓度的Cu2+处理导致梭鱼草叶片单位时间光反应中心的关闭速度显著减慢，说明高质量浓度Cu2+处理下电子传递的速率减慢。

2.3.4 对梭鱼草叶片比活性及表观能量流参数的影响

随溶液中Cu2+质量浓度的增加，梭鱼草叶片单位反应中心吸收的光能(AB，S/RC)、单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TR，o/RC)和单位反应中心消耗的能量(DI，o/RC)呈增加趋势，而单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ET，o/RC)无显著变化(表4)。与CK相比，在25 mg·L-1Cu2+处理下，叶片AB，S/RC增加了91.02%；5、10 mg·L-1Cu2+处理下，叶片TR，o/RC分别增加了24.29%、40.95%；25 mg·L-1Cu2+处理5 d时，叶片DI，o/RC升高至CK的4.20倍。上述分析表明，在较高质量浓度Cu2+处理下，梭鱼草叶片捕获电子的能力及捕光天线面积增加，并以热耗散的形式来减缓过量Cu2+对PSⅡ反应中心的破坏。

如表5所示，各处理组中梭鱼草叶片AB，S/CS，o、TR，o/CS，o与CK相比无明显变化。在最高质量浓度Cu2+处理下，叶片ET，o/CS，o比CK降低了55.27%，且达到极显著水平，表明单位激发态面积的叶片光合能力下降。随溶液中Cu2+质量浓度的增加，叶片DI，o/CS，o呈上升趋势；当溶液中Cu2+质量浓度为25 mg·L-1时，叶片DI，o/CS，o为CK的2.29倍，这有利于减缓过剩激发能对PSⅡ反应中心的破坏。

表4不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片比活性参数的影响

处理AB,S/RCTR,o/RCET,o/RCDI,o/RCCK(2.56±0.11)Bb (2.10±0.07)Bb (1.11±0.01)Aa(0.46±0.04)AbT1(3.42±0.41)ABab(2.53±0.15)ABab(1.18±0.01)Aa(0.88±0.26)AabT2(3.64±0.51)ABab(2.61±0.17)ABa(1.26±0.06)Aa(1.03±0.33)AabT3(4.89±0.68)Aa(2.96±0.13)Aa(0.77±0.38)Aa(1.93±0.55)Aa

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

叶绿素的质量分数可以反映植物利用光能和适应外界环境的能力。研究表明，重金属胁迫会抑制植物光合色素的生物合成，破坏PSII反应中心电子传递，不利于光合作用[7]。本研究发现，较高质量浓度Cu2+处理下梭鱼草叶片出现明显的褪绿现象，与叶片光合色素质量分数的下降密切相关。产生这一结果的原因可能是，过量Cu2+使叶绿素酶活性增加，叶绿素分解速率加快[17]；Cu2+与叶绿素中的蛋白质巯基结合或取代其中的Fe2+、Mg2+、Zn2+，改变叶绿素蛋白结构[17]。类胡萝卜素是一类非酶促活性氧淬灭剂，能够中断链活性氧的反应[18]，5 mg·L-1的Cu2+处理下类胡萝卜素质量分数显著增加，这可能与叶片通过积累类胡萝卜素清除单线态氧(1O2)等活性氧，使叶片免受活性氧伤害有关[19]。

表5不同质量浓度Cu2+对梭鱼草叶片表观能量流参数的影响

处理AB,S/CS,oTR,o/CS,oDI,o/CS,oET,o/CS,oCK(560.78±19.30)Aa(460.89±12.43)Aa(99.88±7.89)Ab (243.11±7.73)Aa T1(609.33±22.06)Aa(464.15±34.64)Aa(145.18±17.16)Aab(219.90±22.83)ABaT2(606.89±44.28)Aa(454.13±52.00)Aa(152.76±7.72)Aab(224.96±28.66)ABaT3(593.75±100.25)Aa(370.41±25.42)Aa(228.43±74.84)Aa(108.74±41.30)Bb

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差；同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

在逆境条件下，植物光合速率下降的原因包括气孔因素和非气孔限制因素。Farquhar et al.[20]认为，若随叶片Gs的下降，气孔限制值(Ls)下降，则说明Pn下降的原因为气孔因素；若随气孔导度(Gs)的下降，Ci不变或升高，则说明Pn下降为非气孔限制因素，即叶肉细胞光合活性下降，如核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶活性的降低[21]。本试验中，随溶液中Cu2+质量浓度的增加，梭鱼草叶片Ci无明显变化，Gs与Pn均呈下降趋势，这与其他学者在水稻(Oryzasativa)[22]上的研究结果相一致，表明随Cu2+质量浓度增加，梭鱼草叶片Pn的下降主要是由受非气孔因素引起的。叶片水分利用效率(WU，E)能够表征植物对自身蒸腾耗水量的利用能力，是决定植物在逆境中能否正常生长的重要因素[23]。本研究中，Cu2+质量浓度≥10 mg·L-1时，梭鱼草叶片WU，E比对照组下降了43.85%～52.31%，表明Cu2+破坏了梭鱼草植株对水分的吸收和利用，试验期间观察的梭鱼草叶片干枯、卷曲支持了这一观点。气孔是外界水分和气体进入植物叶肉细胞的重要门户，能够直接感知叶片VP，D的变化，并随叶片VP，D增加呈下降趋势[24]。本研究中，梭鱼草叶片VP，D与Gs具有明显的负相关关系(y=-19.495x+822.11，R2=0.900 5)，表明Cu2+处理导致叶片VP，D的增加诱使气孔导度下降，从而妨碍蒸腾作用，导致叶片水分代谢失衡。

在环境胁迫条件下，合理调整和分配PSⅡ反应中心的能量是提高植物光合适应性的重要途径之一。植物叶片PSⅡ反应中心吸收的光能(AB，S/RC、AB，S/CS，o)主要用于电子传递(ET，o/RC、ET，o/CS，o)、能量耗散(DI，o/RC、DI，o/CS，o)和质体醌还原(TR，o/RC)等[30，34]。本研究中，在最高质量浓度Cu2+处理下，梭鱼草叶片AB，S/RC、TR，o/RC显著高于对照组，这是由于单位面积的反应中心数目减少及剩余有效反应中心效率增强，以更好的耗散电子传递链中的能量[35]。表明叶片天线色素吸收和捕获的光能大部分以热量形式耗散，导致DI，o/RC升高，这可能有利于维持梭鱼草叶片光能吸收与利用能量之间的平衡[36]。但也有学者认为胁迫下反应中心密度下降，导致单个反应中心接受的光能负担急剧增加，使得AB，S/RC、TR，o/RC、DI，o/RC增大，这种现象会加速胁迫对有活性反应中心的破坏[37]。因此，对胁迫下植物光合机构的能量传递、利用过程需要更进一步的研究。高质量浓度Cu2+还会导致梭鱼草反应中心光能利用率下降，表现为电子传递能量(ET，o/CS，o)的下降和热耗散能量(DI，o/RC和DI，o/CS，o)的增加，与重金属胁迫下浮萍(Lemnagibba)[38]叶片光合反应中心能量分配的变化相一致，表明过剩的激发能主要以热耗散的形式淬灭，这可能是较高质量浓度Cu2+处理下梭鱼草叶片光合机构进行自我保护的机制之一，有利于减缓过剩激发能损伤叶绿体类囊体膜和光系统ⅡD1蛋白周转[27]。

综上所述，梭鱼草对低质量浓度(5 mg·L-1)Cu2+综合表现出较好的光合适应能力，能够维持相对稳定的光合色素质量分数和光合生理活性，这很可能与类胡萝卜素质量分数的增加有关。随Cu2+质量浓度升高，非气孔因素是导致梭鱼草叶片Pn下降的主要原因。同时，较高质量浓度Cu2+会降低梭鱼草叶片PSII反应中心活性，但其可通过关闭部分反应中心、增加热耗散等途径减缓Cu2+对光合机构的破坏。