黄条金刚竹开花生物学特性及花粉萌发力1)

姚文静 姜明云 王星 史无双 丁雨龙 林树燕

(南京林业大学,南京，210037)

植物开花是高等植物由营养生长转向生殖生长的重要标志，决定了植物生殖发育的时期和质量，研究植物开花对于其生殖发育具有重要意义[1]。植物开花受光照、温度、激素等外界环境因素和基因调控等内在遗传因素的共同调节[2]。开花特性及花粉萌发是开花生物学中非常重要的研究内容，为结实性相关研究提供理论基础[3]。竹类植物属于禾本科植物，具有更长的幼年期和营养生长阶段，营养生长周期可长达几十年甚至上百年[4]。多数竹子是典型的多年生一次开花植物，开花后往往会出现大面积的死亡，甚至导致全林枯死，给竹子开花生物学研究带来了极大困难[5]。因此，竹子从营养生长到生殖生长的转变过程，即竹子开花过程，更值得深入研究。

植物花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力。花粉生活力由遗传基础决定，同时受各种外界环境的影响，包括温度、相对湿度、贮藏介质、辐射、光照等[6]。竹类植物花粉萌发率普遍较低，且存在不同类型的败育现象，竹花自然授粉不良[7]。自然条件下，竹子花粉容易因温度过高和空气干燥使花粉破裂皱缩失活，大大降低了竹子结实率[7]。因此，育种过程中人工辅助授粉成为提高竹子授粉率和种实产量的重要手段。然而人工授粉过程中，花粉的采集和储存会使花粉生命力受到一定程度的影响，导致授粉成功率下降[5]。因而，花粉的形态及萌发特性成为竹子开花生物学中非常必要的研究内容。

黄条金刚竹(Sasaellakongosanensis‘Aureostriatus’)是东笆竹属金刚竹的一个变异类型，具有较高的观赏价值。2015年3月份南京林业大学黄条金刚竹出现开花现象，为其开花生物学特性研究提供了契机。文中对黄条金刚竹的开花类型、开花期、花序及花粉形态、花粉萌发力、开花林相等进行了系统详细的研究，为了解其开花特性及引种栽培等提供了数据基础。此外，本研究进一步丰富了竹类植物生殖生物学的理论研究，也为其他竹类植物开花相关研究提供参考依据。

1 研究地概况

试验地点位于江苏省南京林业大学(118°48′17″E，32°4′44″N)，土壤属于下蜀系黄壤，气候属于亚热带季风气候，四季分明，春秋短、冬夏长。雨量充沛，平均降水量为971.7 mm，全年积温(10 ℃以上)为4 897 ℃，年平均气温为15.7 ℃，全年无霜期233 d。年温差较大，7月份平均28 ℃，1月份平均2.2 ℃。

2 材料与方法

黄条金刚竹是东笆竹属(Sasaella)金刚竹的一个变异类型，于1984年8月份由周芳纯教授从日本富士竹类植物园引种到南京林业大学[8]。直至2015年还未有关于其开花结实的相关记载或报道。2015年3月份在南京林业大学竹种园开花。本研究用于花粉萌发力测定的材料采自开花黄条金刚竹盛花期成熟且未散粉的花药。

2016年每月定点观察，详细记录1年间黄条金刚竹开花林相的变化。

开花进程：小穗开花进程观察，标记30个成熟小穗，记录小穗中小花数量及小穗的开花进程。记录内容包括已开放的小花数目、半开放的小花数目以及将要开放的小花数目，直到30个小穗全部观察完毕。

花粉形态观察：采成熟未散粉的花药用70% FAA固定24 h。用蒸馏水将花粉FAA洗去，依次经过70%-90%-100%(两次)的乙醇梯度脱水。在英国EMITECH公司K850临界点干燥仪中干燥，将花粉粘台，利用日本日立公司E1010离子溅射仪喷金，在美国FEI(菲达康)有限责任公司Quanta 200环境扫描电子显微镜镜下进行拍照与观察。

花粉活力测定：花粉活力测定采用I2-KI染色测定法。花药随采随用。收集成熟未散粉的花药置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。活力强的花粉呈紫黑色或着深色，活力弱或无活力的花粉染色浅或不着色。将染色后花粉置于显微镜下进行观察，统计显微镜各个视野中花粉粒总数和各类型染色花粉粒数，计算花粉活力。每次检查10个视野，每视野花粉粒数大于25，重复3次。

最佳花粉萌发时间确定：最佳花粉萌发时间采用培养基发芽法[9]进行确定。于盛花期采取新鲜未散粉的花药，用湿报纸包裹至实验室。将花药用解剖针和镊子搅碎，置于简单液体培养基中(150 g·L-1蔗糖+0.010 g·L-1硼酸)，于25 ℃环境中培养观察。观察时间由1 h到4 h，时间间隔为0.5 h，选出黄条金刚竹花粉萌发的最佳观测时间。在不同观察点，用吸管取一滴溶液滴于载玻片上，盖上盖玻片，利用显微镜进行统计。每次统计需10个视野，每次镜检的花粉总数不少于200个，设置3个重复，统计萌发花粉总数及花粉总数，计算萌发率。花粉萌发率=(总萌发花粉数/花粉总数)×100%。

花粉萌发最适培养基筛选：通过正交试验法将不同质量浓度的蔗糖、硼酸和CaCl2·2H2O设置成16种组合，pH值5.8，以明确适宜黄条金刚竹花粉萌发不同质量浓度培养基组分的最佳组合。

3 结果与分析

3.1 开花林相

黄条金刚竹开花属于成片开花类型。由于2015年3月份黄条金刚竹在南京林业大学校园内开花导致2016年1月份呈枯黄状(图1A)。2016年2月下旬黄条金刚竹新老植株顶端出现大量花芽(图1B、C)。2016年3月中旬黄条金刚竹部分开花植株开始抽穗(图1D、E)。4月上旬大量植株开花即盛花期(图1F)，并且出现大量笋芽。5月下旬依然有少数植株开花(图1G)。9月份黄条金刚竹基部有大量笋芽产生(图1H)。10—11月份黄条金刚竹新生幼竹进行高生长。12月份部分开花植株衰老死亡(图1I)。

3.2 小穗开花进程及小花开花动态

根据观察，每一小穗交互排列着7～9朵小花，小穗开花为下始式，一般小穗的花由基部向顶部依次开放；单一小穗上自第一朵小花开放直至全部开放需要4～7 d。黄条金刚竹花序的开放是有次序的，不同花序上各部位小穗的开花进程为由底部到顶部。

于2016年4月份盛花期，对黄条金刚竹20朵小花进行观察统计，得出黄条金刚竹小花从花药微露至花药全部开裂所需时间为7～9 h，从全部开裂到内外稃闭合需要2 h左右。以其中3朵小花开花进程为例，07:00花药微露(图2A)—09:05露出大半(图2B)—11:20全部露出(图2C)—11:59趋于下垂(图2D)—12:30完全下垂(图2E)—15:28花药全部开裂—16:45内外稃闭合(图2F)；11:30花药微露—13:40露出大半—16:00全部露出—16:40趋于下垂—17:20完全下垂—19:35全部开裂—21:05内外稃闭合；09:00花药微露—11:05露出大半—13:30全部露出—14:08趋于下垂—16:05完全下垂—17:50全部开裂—19:46内外稃闭合。

A.1月份黄条金刚竹竹林；B、C.2月份出现花芽；D.3月中旬抽穗；E.3月下旬部分植株开花；F.4月上旬盛花期；G.5月上旬盛花期后；H.9月份地下鞭上出现大量笋芽；I.12月部分开花植株衰老死亡。

图1黄条金刚竹开花林相

A、B.内外稃片微微张开；C.花药露出大半；D.花药全部露出且微下垂；E.花药完全下垂；F.内外稃闭合。

3.3 花粉特征

黄条金刚竹花粉外表呈近球形(图3A)，具单个萌发孔(图3B)，孔明显，圆至椭圆形，萌发孔内凹，孔周围具加厚不一的孔环(图3C)。花粉粒平均直径约(28.46±5)μm。花粉外壁纹饰为细颗粒状。

A.花粉外在形态；B.单个萌发孔；C.孔环。

3.4 花粉活力

在普通光学显微镜下观察30个视野，统计不同颜色的花粉，结果如下，共镜检花粉数为593粒，其中蓝色花粉数量为456粒，即发育良好的花粉数为456，占总镜检数量的76.9%；发育不良的花粉数量为99粒，占总数的16.7%；无活力花粉为38粒，占总数的6.4%；发育不良以及无活力花粉共占总数的23.1%。

3.5 花粉萌发时间以及萌发最适培养基的确定

收集黄条金刚竹盛花期花粉置于培养基中培养不同时间，分别观测其花粉萌发率(图4)。结果表明，随着时间的延长，花粉萌发率逐步提高。培养2.5 h黄条金刚竹花粉萌发率高达38.5%(图4B)，3 h趋于平稳(图4C)，之后不再随着时间延长而提高。因此，观察统计黄条金刚竹花粉萌发率的最佳时间为培养后2.5 h。

A.黄条金刚竹花粉在培养基中培养2 h;B.黄条金刚竹花粉在培养基中培养2.5 h；C.黄条金刚竹花粉在培养基中培养3 h。

黄条金刚竹在不同培养基中的萌发率不同，由表1可以看出，黄条金刚竹的花粉在150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O的培养基上萌发率最高，为38.91%±1.12%；在200 g·L-1蔗糖+0.005 g·L-1硼酸+0.007 g·L-1CaCl2·2H2O的培养基上萌发率最低，为18.22%±3.27%。在蔗糖质量浓度一定的条件下，随着硼酸质量浓度的增加，萌发率呈增加趋势；蔗糖质量浓度为150 g·L-1的时候，萌发率总体上较高，而在蔗糖质量浓度为200 g·L-1时，萌发率随之降低。而硼酸质量浓度一定的条件下，随着蔗糖质量浓度的增加，萌发率先升高后降低。通过比较，最适合花粉萌发的培养基是150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O。

表1黄条金刚竹在不同质量浓度培养基组分条件下的花粉萌发率

组合编号蔗糖质量浓度/g·L-1硼酸质量浓度/g·L-1CaCl2·2H2O质量浓度/g·L-1萌发率/%1500.0050.147(18.73±1.18)d 2500.0100.294(24.53±2.81)cd3500.0150.441(30.70±10.50)abc4500.0200.007(34.89±6.70)ab51000.0050.294(22.77±5.31)cd61000.0100.441(25.61±2.74)cd71000.0150.007(28.13±5.01)bc81000.0200.147(37.23±3.26)ab91500.0050.441(31.75±4.62)abc101500.0100.007(35.33±2.40)ab111500.0150.147(36.17±3.00)ab121500.0200.294(38.91±1.12)a132000.0050.007(18.22±3.27)d142000.0100.441(23.70±4.35)cd152000.0150.294(25.67±2.90)cd162000.0200.147(28.61±7.42)bc

注：表中萌发率数据为平均值±标准差；同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

4 结论与讨论

大多数竹种为一次性开花植物，开花结实后，竹株进入衰老死亡[10]。但也有竹种花后经过复壮而继续无性生长，即开花株秆花后死亡，但由鞭根不断生出新的竹株，反复几年后整片竹林不再开花[5]。林新春等[11]对雷竹林的开花林相进行观察，发现开花竹株与未开花竹株并存，开花竹林整体呈枯黄色，竹秆黄色，夹杂着枯死竹株。雷竹林开花后竹笋产量急剧下降，粗壮竹笋很少甚至没有，且非笋期出笋较多，形成矮小开花竹丛，开花后即枯死。开花麻竹与未开花麻竹相比，同化能力较差，异化作用较大，光合系数小，叶质质量(单位叶面积质量)和N、P、K及灰分等含量低[12]。开花会影响竹子的生理生化，竹林大面积开花会引起林相衰败，不仅造成严重的经济损失，还会破坏生态环境[13]。本研究对黄条金刚竹开花竹林林相进行了追踪观察，发现黄条金刚竹开花后，开花植株衰老死亡，但地下鞭根系统会生出新的竹株，如此反复，从开花至今已经5 a，目前仍处于花期。

竹子开花类型可分为全体成片开花、零星开花；开花后死亡、开花后不死；开花后结实、开花后不结实等类型[14]。竹子开花原因主要解释为内因论和外因论，内因论认为，竹子开花受其独特的生物钟调控，外因论认为，竹子开花受外界环境变化所引发[15]。1984年到1996年在南京林业大学竹类植物园发现11种竹子开花，包括篌竹(Phyllostachysnidularia)、水竹(Ph.hetercolada)、寿竹(Ph.bambusasoides)等[16]。近年来，在南京林业大学竹种园内开花的竹子有月月竹(Chimonobambusasichuanensis)、鹅毛竹(Shibataeachinensis)、孝顺竹(B.multiplex)等[17-19]。2015年，黄条金刚竹在南京林业大学校园内开花[20]，2016年通过每月定点观察，黄条金刚竹属于开花不定期、成片开花类型。

目前，有关竹子花器官形态和结构解剖的研究报道较多。例如，邢新婷等[21]对麻竹(D.latiflorus)小穗结构及花器构造进行了观察研究；彭晟等[22]对云龙箭竹(Fargesiapapyrifera)和元江箭竹(F.yuanjianggensis)的花序特征做了详细研究；林树燕等[23-24]对月月竹和孝顺竹的花芽分化及孢子发生与雄配子体发育进行了研究。竹子的花一般为颖花，由外稃、内稃、浆片、雄蕊、雌蕊5个部分构成。根据花的构造和开花特点，可将竹子的花分为开放型和闭合型两种[25]。开放型小花开花时浆片因吸水而膨胀，将内外稃片撑开，此时雄蕊伸出，随后雌蕊柱头也伸出稃片接受花粉，如异叶苦竹(Pleioblastussimoniif.albostriatus)[18]、孝顺竹[23]、月月竹[24]等；闭合型的小花开放时内、外稃不打开，开花时花药从稃片顶端伸出，随花丝伸长，花药、花丝逐渐伸出稃片，如鹅毛竹[18]。本研究表明，黄条金刚竹开花为开放型，当小花发育成熟时，浆片吸水膨胀将稃片撑开，花药伸出，风媒传粉。

竹类植物花粉形态比较一致，为球形或近球形，单个萌发孔，花粉粒直径一般为20～100 μm，各竹种间花粉外壁纹饰有差异。张文燕等[26]通过扫描电镜对12种散生竹类花粉进行观察，发现竹子花粉形状均呈近球形，萌发孔形状近圆形且大小不同，并且孔周围有厚度不一的孔环。汪奎宏等[27]观察早竹的花粉外观，发现花粉有两层壁，其中花粉外壁有较密集的细颗粒状纹饰。本试验利用扫描电镜对黄条金刚竹花粉形态进行了观察，花粉粒形态近球形，有明显的萌发孔，近圆形且内凹，萌发孔具有孔环和孔盖，外壁有细颗粒状的纹饰。但不同竹种的花粉大小不同，同为刚竹属的粉绿竹花粉粒平均直径为80.86 μm，黄条早竹为74.32 μm，黄槽石绿竹为62.85 μm[7]；其他属的竹种如异叶苦竹为27.86 μm，鹅毛竹为40.22 μm[18]，孝顺竹为36.77 μm[19]。张文燕等[3]认为，竹子花粉粒的大小与花药长度密切相关，即花药越长，花粉粒越大。前期研究已对异叶苦竹、鹅毛竹、月月竹等进行比较，也得出类似结论[18，24]。粉绿竹花药长度平均为13 mm，花粉粒平均直径为80.86 μm[3]；孝顺竹花药长度为10～12 mm，花粉粒平均直径为36.77 μm[19]。本试验中，黄条金刚竹的花药平均长度为8～10 mm，花粉粒平均直径为(28.46±5)μm。

花粉萌发是影响竹类植物结实的重要条件，竹子花粉活力及萌发率相关研究较多。例如，张文燕等[26]对12种竹类的花粉萌发率的研究结果表明，竹类植物花粉萌发率普遍较低，最高不超过53.4%。汪奎宏等[27]利用I-KI染色法测定早竹的花粉活力为50%，培养基法测定的花粉萌发率为25.9%；林树燕等[28]利用I2-KI染色法测定月月竹、异叶苦竹、鹅毛竹、福建茶秆竹、短穗竹(Semiarundinariadensiflora)的花粉活力分别为56%、78%、39%、68%、35%，培养基法测定的花粉萌发率分别为35.7%、76.5%、9.1%、60.0%、5.3%；李晓芬等[29]利用TTC染色法测定紫竹花粉活力为90%，培养基法测定花粉萌发率为8.0%。林树燕等[30]测定了刚竹属的黄槽石绿竹、粉绿竹和黄条早竹3个竹种的花粉萌发率，分别是58.7%、37.2%和21.7%。在已有相关研究的竹子中，花粉萌发率最低的是短穗竹(5.3%)，最高的是异叶苦竹(76.5%)，异叶苦竹的结实率较高，短穗竹则基本不结实[18，28]。经过比较发现，各竹种间花粉活力相差很大，且用染色法测定的花粉活力一般都较高，萌发率一般较低。本研究采用I2-KI染色法测定黄条金刚竹的花粉活力是76.9%，培养基法测定花粉萌发率最高为38.91%±1.12%。另外，明确了适宜黄条金刚竹花粉萌发的最适培养基是150 g·L-1蔗糖+0.020 g·L-1硼酸+0.294 g·L-1CaCl2·2H2O，其中低质量浓度硼酸对花粉萌发具有明显的促进作用，这与张文燕等[3]石翠绿竹和五月季竹花粉生活力相关研究中10%蔗糖液中再加入5 μg·g-1硼酸可明显提高花粉发芽率的研究相似。

竹林成片开花后林相衰败,只能通过有性天然/人工更新或无性复壮更新恢复[5]。竹子引种是避免竹子林相过快衰败，提高竹子产量和质量的有效措施。竹子引种应考虑竹种本身优良特性和适宜生态环境，了解其栽培历史及生长情况[18]。为预防竹林大面积开花，可选择起源和开花周期不同的竹苗造“混交”林，或混栽竹秆大小和出笋期大致相同的两种或两种以上的不同竹种[18]。另外，应及时砍除开花竹株,利于再生竹提早出笋,促进开花竹林的复壮更新[5]。本研究中黄条金刚竹竹林开花后，在没有人工干预情况下基部有大量笋芽产生，竹林林相是否可通过有性天然或无性复壮更新还有待继续观察。