基于红曲高产莫纳可林K的固态发酵工艺条件优化

张占军，王富花

（1.扬州市职业大学工程研究中心，江苏扬州225009；2.扬州工业职业技术学院化学工程学院，江苏扬州225127）

红曲又称“红米”、“丹曲”、“福米”，是将红曲霉属真菌接种于蒸熟的大米上进行固态发酵而成的一种药食两用物质[1]，在我国有着上千年的生产及应用史，普遍应用在酿酒[2]、红腐乳制造[3]、食醋生产[4]、发酵饮料[5]、肉制品[6]以及降压降脂药物[7]等方面。1979年日本学者远藤章[8]从红曲霉的次级代谢产物中分离得到了一种能有效抑制胆固醇合成的活性物质，命名为莫纳可林K（Monacolin K）。1980年美国科学家Alberts[9]在土曲霉中发现了同样具有抑制胆固醇作用的活性物质洛伐他汀（lovastatin）。由于红曲是天然固态发酵产品，无需经过任何提纯，在安全性方面更比处方药洛伐他汀安全可靠[10]。且其发酵产物中除了含有莫纳可林K之外，还有一系列洛伐他汀结构类似物、Y-氨基丁酸等生理活性物质存在，这些相关成分和莫纳可林K相联合，不仅具有协同调节血脂的功效，而且还极大地降低了纯品洛伐他汀的副作用[11-13]。随着人们对以红曲霉开发的保健食品、保健药品等红曲产品的需求日益增大，深入研究如何有效提高红曲固态发酵中莫纳可林K的含量，对红曲产品的进一步开发及应用具有深远的意义。近年来国内外对于红曲固态发酵高产莫纳可林K，主要集中于选育高产菌种、控制环境因子和优化培养基等方面，单方面研究的较多，本研究通过结合环境因子及培养基两方面，综合优化提高莫纳可林K的产量。

本试验拟采用响应面优化法，以红曲高产莫纳可林K为响应值，通过考察接种量、装料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量等因素，采用Box-Behnken中心设计法，建立并验证相关的工艺数学模型，以期对如何有效提高红曲固态发酵过程中莫纳可林K的产量提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 试验菌种

烟灰色红曲霉（Monascus buliginosus Sato）：中心实验室收集并保存。

1.1.2 培养基

斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯20 g，葡萄糖2.0 g，琼脂1.5 g，蒸馏水100 mL，pH值自然。

种子培养基：蛋白胨20 g，玉米面20 g，酵母浸膏10 g，硫酸镁 0.5 g，磷酸氢二钾 1 g，硫酸亚铁 0.1 g，pH 6.0蒸馏水1 000 mL，pH值自然，121℃灭菌20 min。

固态发酵培养基：籼米浸泡5 h后蒸熟无夹生，取适量置于250 mL灭菌三角瓶，加玉米粉、蛋白胨各适量，于121℃，0.1 MPa灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

Monacolin K标准品：美国Sigma公司；马铃薯、玉米面、籼米：市售；蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、硫酸镁、琼脂、磷酸氢二钾、硫酸亚铁：成都市科龙化工试剂厂。甲醇、乙腈、磷酸（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2G超净工作台：苏州净化设备有限公司；DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂；1260型高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；SB-5200DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-KBS压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 红曲固态发酵制备方法

将红曲霉的斜面孢子适量刮入装有无菌水的三角瓶中，振荡摇匀后用无菌脱脂棉过滤，稀释至浓度约106个/mL，然后以2%的接种量接种于种子培养基中，28℃下以160 r/min摇床振荡培养48 h。将培养好的种子液按需要的接种量接种到固态发酵培养基，变温培养15 d即得发酵红曲。

1.3.2 红曲中莫纳可林K的检测方法

检测方法参考文献报道[14]的方法，将发酵红曲50℃下烘干粉碎至40目，准确称取0.5 g至50 mL容量瓶中，加甲醇超声提取1 h后4 000 r/min离心10 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后经高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测并根据Monacolin K标准曲线计算莫纳可林K含量（mg/g）。

色谱条件：ZORBAX 300SB-C18（150 mm×4.6 mm×5 μm），流动相为乙腈 ∶水 ∶0.5%磷酸=60 ∶35 ∶5（体积比），柱温30℃，检测波长为238 nm，流速为1.0 mL/min，进样量 20 μL。

1.3.3 单因素试验

进行一系列单因素试验，在采用变温发酵（前3 d 30℃，后12 d 26℃），发酵时间15 d固定的条件下，选取接种量、装料量、碳源添加量、氮源添加量等四个因素分析其对红曲固态发酵莫纳可林K产量的影响。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验确定的各变量范围，选取接种量（A）、装料量（B）、玉米粉添加量（C）和蛋白胨添加量（D）为自变量，莫纳可林K产量为响应值，通过Design Expert 8.0.6软件，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，进行4因素3水平的响应面分析试验，同时对试验数据进行回归分析，预测高产莫纳可林K的固态发酵工艺最佳条件。试验因素及水平编码如表1所示。

表1 Box-Behnken响应面试验设计因素和水平Table 1 Variables and levels in the three-level，three-variable Box-Behnken experimental design

1.3.5 数据处理方法

单因素试验数据测定3次，以Mean±SD方式表示，响应面试验采用Design Expert 8.0.6软件进行结果分析，通过SPSS 22.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 接种量对红曲霉产莫纳可林K的影响

适宜的接种量对于红曲霉的正常生长代谢是至关重要的。在装料量30 g/250 mL、玉米粉添加量1%、蛋白胨添加量1%的条件下进行变温发酵，接种量对红曲霉产莫纳可林K的影响如图1所示。

图1 接种量对红曲霉产莫纳可林K的影响Fig.1 Effects of different inoculum size on the yield of Monacolin K

由图1可知，在接种量达到15%之前，随着接种量的增加，莫纳可林K的产量也在增加，接种量达15%时，莫纳可林K的产量最高，为9.25 mg/g。此后继续增大接种量对莫纳可林K的产生反而起抑制作用。可能原因是较大的接种量有利于红曲霉产生更多的代谢产物，但如果接种量过大，将导致菌体生长过快而不利于代谢产物的形成，同时代谢产物的积累对发酵过程产生反馈抑制作用。另一方面，代谢产物的不断形成还可能增大发酵培养基黏度，从而妨碍传质过程，最终影响菌体生长代谢。因此选择最佳接种量为15%。

2.1.2 装料量对红曲霉产莫纳可林K的影响

装料量的大小影响到红曲霉生长代谢过程中的散热与供氧，因而与莫纳可林K的生成有重要关系。在接种量10%、玉米粉添加量1%、蛋白胨添加量1%的条件下进行变温发酵，装料量对红曲霉产莫纳可林K的影响如图2所示。

图2 装料量对红曲霉产莫纳可林K的影响Fig.2 Effects of different loading volume on the yield of Monacolin K

图2表明，在装料量为30g/250mL时，莫纳可林K的产量达到最大值7.26mg/g。此后再增大装料量，莫纳可林K的产量开始下降。更大的装料量对莫纳可林K的生成起到了抑制作用，这可能是由于发酵过程中红曲霉的生长代谢活动导致发酵基质黏度变大，通透性降低，影响了散热进程，造成物料内部温度升高，进而影响到代谢产物的生成。因此选择最佳装料量为30 g/250 mL。

2.1.3 玉米粉添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响

文献报道[15]在红曲霉发酵过程中以玉米粉作为碳源要优于葡萄糖、可溶性淀粉等其他碳源。主要是由于玉米粉作为有机碳源，营养丰富全面，有利于红曲霉前期快速生长。在接种量10%、装料量30 g/250 mL、蛋白胨添加量1%的条件下进行变温发酵，玉米粉添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响如图3所示。

图3 玉米粉添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响Fig.3 Effects of different quantity of corn meal on the yield of Monacolin K

从图3可以看出，随着玉米粉添加量的增加，莫纳可林K的产量也逐渐升高。当玉米粉的添加量达到3%时，莫纳可林K的产量达到最大的8.66 mg/g。而当玉米粉添加量继续增加时，莫纳可林K的产量反而下降，这表明过大的添加量并不利于莫纳可林K的产量的增大。原因在于玉米粉本身黏度较大，添加量越多，通气量降低，导致生物量的积累下降从而使红曲霉的生长及代谢产物的生成受到了一定的抑制。因此选择玉米粉的最佳添加量为3%。

2.1.4 蛋白胨添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响

文献报道[16]蛋白胨是红曲菌产Monacolin K的最佳氮源。接种量10%、在装料量30 g/250mL、玉米粉添加量1%的条件下进行变温发酵，蛋白胨添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响如图4所示。

图4 蛋白胨添加量对红曲霉产莫纳可林K的影响Fig.4 Effects of different quantity of peptone on the yield of Monacolin K

图4表明，随着蛋白胨添加量的增加，莫纳可林K的产量也逐渐升高。当蛋白胨的添加量达到2%时，莫纳可林K的产量达到最大的7.91 mg/g。因此选择蛋白胨的最佳添加量为2%。

2.2 响应面法对高产莫纳可林K的固态发酵工艺条件的优化

2.2.1 响应面试验设计与结果

在对红曲霉产莫纳可林K的影响的单因素试验基础上，利用Design Expert软件进行四因素三水平的响应面分析方法进行发酵条件的优化，试验方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken设计模型及试验值Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values

续表2 Box-Behnken设计模型及实验值Continue table 2 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.2.2 红曲固态发酵产莫纳可林K回归模型的建立及方差分析

利用Design Expert软件对表2中的试验数据进行回归分析，得到红曲固态发酵莫纳可林K产量对以上4个因素的回归方程为：

莫纳可林K产量=10.88+0.68A+0.62B+0.47C+0.23D+0.61AB+0.23AC+0.045AD+0.098BC-0.27BD+0.21CD-1.13A2-0.73B2-0.88C2-0.24D2

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

该模型的确定系数为R2=0.971 8，模型的调整确定系数为R2adj=0.943 6。同时从表3可以看出：模型F值为34.48，p＜0.000 1，表明模型是高度显著的，模型的失拟项p=0.072 6，表明失拟不显著，说明该模型较稳定，能较好地预测实际红曲霉固态发酵莫纳可林K产量情况。模型一次项A（接种量）、B（装料量）、C（玉米粉添加量）、部分交互项（AB、BD）及部分平方项（A2、B2、C2）均极显著，一次项D（蛋白胨添加量）及平方项（D2）均显著，表明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.3 响应曲面图分析优化

响应曲面图是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[17]。通过Design Expert软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，红曲固态发酵过程中接种量、装料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量4个因素之间对莫纳可林K产量影响的响应面图如图5所示。

图5表明，当红曲固态发酵底物中玉米粉添加量和蛋白胨添加量一定时，当接种量位于15%～20%，装料量在30 g/250 mL～35 g/250 mL范围内时，两者交互作用对红曲固态发酵莫纳可林K产量的影响最大，且极显著（图5a）；当装料量和蛋白胨添加量一定时，接种量和玉米粉添加量两者交互作用对莫纳可林K产量影响的最大值位于接种量15%～20%，玉米粉添加量3%～5%区域内，两者交互作用不显著（图5b）；当装料量和玉米粉添加量一定时，莫纳可林K产量最大值区域位于接种量15%～20%，蛋白胨添加量2%～3%范围内，增加接种量对莫纳可林K产量的影响明显大于蛋白胨添加量的增加，两者交互作用不显著（图5c）；当接种量和蛋白胨添加量一定时，装料量和玉米粉添加量之间的交互作用对莫纳可林K产量的影响不显著，装料量30 g/250 mL～35 g/250 mL，玉米粉添加量3%～5%为莫纳可林K产量的最大值区域（图5d）；当接种量和玉米粉添加量一定时，装料量和蛋白胨添加量之间的交互作用对莫纳可林K产量的影响极显著，最大值区域位于装料量30 g/250 mL～35 g/250 mL，蛋白胨添加量2%～3%范围内（图5e）；当接种量和装料量一定时，玉米粉添加量和蛋白胨添加量之间的交互作用对莫纳可林K产量的影响不显著，增加玉米粉添加量对莫纳可林K产量的影响明显大于蛋白胨添加量的改变（图5f）。

图5 接种量、装料量、玉米粉添加量和蛋白胨添加量等因素交互作用对莫纳可林K产量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of inoculum size，loading volume，dosage of different quantity of corn meal and different quantity of peptone on the yield of Monacolin K

2.2.4 提取参数优化及模型验证

通过 Design Expert软件可知，当 A＝0.50、B＝0.59、C＝0.40、D＝0.37时，Y 出现理论最大值11.37 mg/g。可得出红曲固态发酵高产莫纳可林K工艺条件为接种量17.50%，装料量32.95 g/250 mL、玉米粉添加量3.80%和蛋白胨添加量2.37%。为验证该模型方程的适用性，进行了6次验证性试验，验证性试验中莫纳可林K产量为11.25±0.13 mg/g，与理论预测值相比较，结果表明p值=0.081＞0.05，因此可以认为采用优化工艺条件所得实验值与理论预测值间无显著差异，即该方程能较好的预测红曲固态发酵过程中莫纳可林K的产量。

3 结论

本研究基于红曲固态发酵高产莫纳可林K，通过单因素及响应面试验，在发酵时间15 d，采取变温发酵的条件下，优化了红曲固态发酵过程中高产莫纳可林K的工艺条件，得到红曲固态发酵高产莫纳可林K工艺条件为接种量17.50%，装料量32.95 g/250 mL、玉米粉添加量3.80%和蛋白胨添加量2.37%，在此条件下，莫纳可林K的产量可达到11.25 mg/g。