雌激素相关受体α、β在结直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系

夏亚斌，胡 昊，金 岩，黄晓旭，许 力，胡凯峰

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 胃肠外科，安徽 芜湖 241001)

结直肠癌(colorectal cancer)是消化道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在癌症相关死亡疾病中排名第4位[1]。近年来，随着饮食结构以及习惯的改变，结直肠癌的发病率呈显著上升趋势，且发病年龄呈下降趋势[2-4]。结直肠癌的发病机制复杂多样，涉及体细胞基因突变、异常基因融合、基因拷贝数变异和表观遗传变化[5-6]。目前国内外针对肿瘤相关基因及因子分子的研究日益深入，旨在最终通过基因及因子分子的检测、调控来预防、治疗肿瘤[7]。雌激素相关受体(estrogen-related receptor，ERR)主要包括α、β、γ三种亚型，即ERRα、ERRβ和ERRγ[8]，有研究表明ERR在控制细胞能量平衡、新陈代谢、生长和发育方面存在不同作用，并与肿瘤的发生发展密切相关[9]。如高效ERRα反向激动剂在三阴性乳腺癌治疗中发挥着有效作用[10]。同时ERR在前列腺癌等多种癌症中高表达，可以有效地对患者的病情进行评估以及预测[11]，但尚缺乏大样本病例研究证实其在结直肠癌中的表达情况及其临床意义，本研究通过检测雌激素相关受体α、β(ERRα和ERRβ)在200例结直肠癌患者组织中的表达，分析其表达在病情评估以及预后判断中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2014年1月～2016年1月在弋矶山医院胃肠外科经手术、病理证实为结直肠癌的患者共200例，分别取癌组织及癌旁组织；30对配对癌和癌旁组织标本提取组织总RNA。结直肠癌病例具备完整的临床病理资料及随访数据。所有患者术前均未接受放、化疗及相关的抗肿瘤治疗。

1.2 免疫组织化学法 采用免疫组织化学法检测患者癌及癌旁组织中ERRα和ERRβ的蛋白表达情况。用于免疫组织化学染色的ERRα多克隆抗体、ERRβ多克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组织化学试剂盒购自Santa Cruz公司。所有组织蜡块按4μm厚度进行切片。癌及癌旁组织免疫化学染色过程：脱蜡水化→抗原修复→去内源性酶→抗原封闭→ERRα及ERRβ一抗孵育→二抗孵育→发色→苏木精复染→脱水、封片、镜检→结果判定。针对染色的强度以及染色的范围进行打分，强度及范围各分为0分、1分、2分、3分(强度无染色记0分，淡黄色颗粒记1分，黄色颗粒记2分，棕黄色颗粒记3分。染色细胞比例评分:阳性染色细胞数<25%记0分，25%～50%记1分，51%～75%记2分，≥76%记3分)。综合两个分数之积进行评分，0～3分认定为低表达，4～9分认定为高表达。由病理科高年资医师按照盲法进行计数并打分。收集患者肿瘤组织中的染色评分结果以及患者的临床数据，分析ERRα和ERRβ表达与结直肠癌临床病理特征(肿瘤浸润深度、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度)以及患者生存情况的关系。

1.3 RT-PCR 按Trizol试剂说明书提取各患者癌及癌旁组织总RNA，检测其纯度及浓度。选取Oligo dT为引物合成cDNA链，然后用RT-PCR方法检测ERRα和ERRβ的mRNA表达，逆转录反应体系为20 μL，PCR反应体系10 μL。反应条件：分别95℃变性10 s，95℃变性5 s、60℃变性31 s，操作循环40次。内参18 s，每个样本至少重复3次。ERRα和ERRβ引物序列见表1。

表1 引物序列

基因前引物后引物ERRαTGCGGTACAGTGTAACTGGGGAAACCGGGCTATCTGCTCGERRβCGAGAGCTACACGTTCACGGGGGTGTCGAGGGAAAAATAG18sCGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGCAAATGCTTTCGCTC

1.4 统计学方法 所有数据结果采用SPSS 20.0统计学软件分析，计量数据采用均数±标准差表示，采用t检验；计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERRα和ERRβ mRNA水平在结直肠癌患者癌组织中呈高表达 本研究采用RT-PCR法分别检测30对患者癌及癌旁组织mRNA的表达，发现ERRα(癌旁组织平均值：6.613±0.3168；癌组织平均值：12.33±0.8014；t=6.63)和ERRβ(癌旁组织平均值：4.547±0.3115；癌组织平均值：9.77±0.4372；t=9.73)在癌组织的表达高于癌旁组织(P<0.01,见图1)，说明结直肠癌患者癌组织中ERRα和ERRβ存在高表达。

图1 肠癌组织中ERRα和ERRβ均存在高表达

2.2 ERRα和ERRβ蛋白水平在结直肠癌患者癌组织中呈高表达 根据免疫组化结果对癌及癌旁组织中ERRα和ERRβ的表达高低情况进行统计，发现在结直肠癌组织中ERRα和ERRβ蛋白高表达率高于其在癌旁组织中的表达情况，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 结肠癌及癌旁组织中ERRα、ERRβ蛋白高表达率比较[n(%)]

组别(n=200)ERRαERRβ癌组织120(60)112(56)癌旁组织58(29)62(31)χ238.9125.43P0.0000.000

表3 ERRα表达高低与结直肠癌临床病理资料的关系

项目ERRα的表达低表达(n=80)高表达(n=120)χ2P年龄/岁 >604163 ≤6039570.0080.98性别 男性5184 女性29360.590.44肿瘤直径 ≤5 cm73109 >5 cm7110.140.87组织分级 高分化22 中分化3122 低分化479610.350.005T分期 T1166 T21717 T31441 T4335616.40.001N分期 N03528 N11022 N21825 N3174511.520.01TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期5141 Ⅲ～Ⅳ期297915.74<0.001远处转移 否79116 是140.210.64

2.3 患者ERRα和ERRβ的表达与肿瘤临床、病理特征的关系 本研究对200例结直肠癌患者组织的免疫组化结果结合临床病理资料进行分析，发现ERRα和ERRβ蛋白表达与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移等临床特征均有相关。两者与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度有关(P<0.05)。结果表明，肿瘤ERRα和ERRβ蛋白与肿瘤浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、TNM分期及肿瘤分化程度差异有统计学意义，与年龄、性别等无相关性(见表3、4)。

表4 ERRβ表达高低与结直肠癌临床病理资料的关系

项目ERRβ的表达低表达(n=88)高表达(n=112)χ2P年龄/岁 >603965 ≤6049470.730.32性别 男性5580 女性33321.430.23肿瘤直径 ≤5 cm80102 >5 cm8100.110.91组织分级 好22 中3518 差51928.470.012T分期 T1168 T22014 T31738 T4355412.160.008N分期 N03330 N11320 N22122 N321414.560.047TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期5438 Ⅲ～Ⅳ期347414.89<0.001远处转移 否86109 是230.170.84

2.4 ERRα和ERRβ表达与患者生存的关系 结合患者预后资料进行分析，发现生存时间<3年的患者，其ERRα和ERRβ高表达率高于生存时间≥3年的患者(P<0.05)(见表5)。

表5 不同生存年份组患者ERRα、ERRβ蛋白高表达率比较[n(%)]

组别(按生存时间)ERRαERRβ≥3年组(n=200)42(21)41(20.5)<3年组(n=200)78(39)71(35.5)χ26.685.54P0.0230.031

3 讨论

ERR被发现是一类与雌激素受体密切相关的核受体，同时也是重要的转录因子，参与人类细胞生物学层面行为的多个过程。研究表明ERR在代谢和癌症等疾病的共同通路上发挥着至关重要的作用[12]。越来越多的研究表明，ERR的异常表达在多种肿瘤的发生发展中具有重要意义。

ERRα和ERRβ是ERR中两个最为重要的亚型。ERRα作为一种位点特异性转录调节因子，被证明通过直接蛋白质-蛋白质接触与雌激素相互作用[13]。目前在肿瘤的研究中获得广泛的关注，如有研究发现ERRα促进三阴性乳腺癌细胞以及膀胱癌的发生发展[14-15]。ERRβ是一种与雌激素受体相似的蛋白质，其异常表达在乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中具有着重要意义[16]。以往对ERR的研究较多集中在与内分泌相关的肿瘤，但ERR在消化系统恶性肿瘤，特别在结直肠癌的发生发展、转移等恶性生物学行为中可能也发挥重要调控作用。

目前ERRα和ERRβ在结直肠癌中的研究国内外文献均有报道，如刘海宏等发现结肠癌组织中ERRα和ERRβ蛋白表达高于癌旁组织，同时其阳性表达与肿瘤浸润深度、远处转移、血管浸润、TNM分期及肿瘤分化程度密切相关[17]。但此研究仅限于结肠癌，纳入统计的ERRα和ERRβ免疫组化病例仅为44例与45例，在说服力上存在一定不足。Ding 等检测了ERRα/β/γ在结直肠癌细胞中的表达，发现只有ERRα存在着显著高表达，ERRα通过上调IL-8的表达，可促进结直肠癌细胞的增殖和迁移[18]。但此项研究只是在细胞生物学角度阐述了ERR在细胞中的作用，缺乏组织水平的验证及临床资料的分析。

本研究收集有完整临床相关资料的200例结直肠癌患者癌及癌旁组织，并通过30对患者的癌组织与癌旁组织ERRα和ERRβ mRNA表达的比较，发现ERRα和ERRβ在癌组织中表达明显升高。免疫组化检测结果也同样表明ERRα和ERRβ的表达在癌组织明显高于癌旁组织。我们结合临床病理资料进行分析，发现ERRα和ERRβ的表达与结直肠癌组织分级、淋巴结转移以及TMN分期等有一定相关性。这说明ERR的表达与结直肠癌癌细胞的恶性行为密切相关，肿瘤的恶性程度越高，分期越晚，侵袭行为越强，ERRα和ERRβ蛋白及mRNA的表达也越高。同时，本研究就ERRα和ERRβ的表达与患者的3年生存期进行分析，发现两者的表达越高，3年的生存率越低，说明ERRα和ERRβ的表达与患者的预后呈负相关。

综上所述，本实验通过检测大样本的结直肠癌患者癌及癌旁组织的表达，证实雌激素相关受体ERRα和ERRβ在结直肠癌患者癌组织中存在高表达，其表达与结直肠癌的发生、发展以及预后密切相关，联合检测ERRα和ERRβ在结直肠癌中的表达有助于评估肿瘤的恶性程度、进展程度以及患者的预后判断，可能成为结直肠癌分子治疗的潜在的生物学靶点。