HIV-1病毒蛋白与细胞膜通道调制

史 可，刘 霞，姜 鸣，白占涛，3*

(1.延安大学生命科学学院；2.多肽资源药物研究中心；3.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000)

上世纪80年代，在美国和欧洲首次出现了第一批艾滋病例后，将其命名为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，随后AIDS在全球广泛流行，成为又一全球范围内的重大流行性疾病。AIDS主要的传播途径为不安全性行为、静脉注射、输血、分娩、哺乳等。1983年，HIV被确定为引起AIDS的病毒，迄今为止已感染了大约3790万人(联合国艾滋病规划署/世卫组织，2019年艾滋病流行更新，www.unaids.org)。

HIV-1是主要攻击CD4+(cluster of differentiation 4)T淋巴细胞的免疫抑制病毒，此外还可感染中枢神经系统，改变感染者的CNS功能，导致疼痛、认知障碍等问题。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的出现，让HIV-1感染成为一种慢性疾病，在治疗过程中CNS内的病毒蛋白继续产生，无法根除病毒。HIV-1病毒蛋白在病毒感染机制中发挥着重要作用，在外周和中枢神经系统的许多细胞类型中还会引起炎症反应。想要改善HIV-1病毒对感染者造成的这一系列问题，需要从病毒蛋白对细胞膜通道调制方面的研究中寻求答案。本文从病毒感染宿主细胞的类型，对机体免疫系统和中枢神经系统的感染机制，HIV-1病毒蛋白在感染机制中的作用，以及对细胞膜通道的调制作用等四个方面进行系统阐述。我们认为病毒蛋白在HIV感染宿主细胞的过程中，协同完成病毒的生命活动周期、感染过程，多维度解析病毒蛋白对细胞膜调制的重要性，可为治疗AIDS提供更多思路。

1 HIV-1感染宿主细胞

HIV是一种正向单链有包膜的RNA病毒，分为HIV-1型和HIV-2型两类。HIV-1毒力强于HIV-2并具有更短潜伏期和更高传染性[1]。目前HIV-1的感染仍无法治愈[2]。基于HIV-1的高感染性、高致病性、传播范围广的特点，加强HIV-1的研究极为必要。

1.1 HIV-1的宿主细胞

HIV-1可感染遍布全身的多种细胞类型(如表1所示)[3]，CD4+辅助性T淋巴细胞是HIV感染的主要靶标[4]，其他细胞类型也易受病毒影响，在感染者的脑部、肠道、心脏、肾脏、关节以及其他组织均可检测到病毒。

表1 HIV-1感染的代表宿主细胞

HIV-1可感染造血系统，主要有树突细胞、巨噬细胞，以及CD4+淋巴细胞[4]等。血液中的树突细胞在体外感染后病毒产量很高，但巨噬细胞被HIV-1感染后病毒产量较低，在神经认知正常的患者中，巨噬细胞中病毒检出率为17%，神经认知障碍患者中的巨噬细胞病毒检出率为30%[5]。

HIV-1在脑部中枢中主要感染星形胶质细胞[4]、小胶质细胞、少突胶质细胞等。感染者的星形胶质细胞和小胶质细胞中均可检测出HIV-1，其中星形胶质细胞在神经认知正常患者的检出率为3%～11%，神经认知障碍患者为14%～19%，小胶质细胞在神经认知正常患者的检出率为14%，神经认知障碍患者则为9%[5]。

病毒较少感染其他种类细胞，如在受试者的肾上皮细胞中检测到HIV-1序列，肝脏样本中检测到病毒DNA、RNA和蛋白质[6]，感染其他种类细胞是否独立持续，甚至是否伴有病毒进化尚不清楚。

1.2 HIV-1感染机制

HIV-1在其包膜糖蛋白(Env，如gp120)介导下与宿主细胞膜的磷脂双层融合，将病毒核心和基因组传递到宿主细胞的细胞质中。gp120与CD4+T淋巴细胞受体结合，引发Env的构象变化，释放gp41进行融合。除了CD4+T淋巴细胞受体，其他细胞表面受体也为病毒提供辅助附着作用[7]。病毒与宿主细胞融合后，病毒复合物转运至宿主细胞核，通过逆转录酶将基因组RNA逆转录成部分双链线性DNA，催化病毒DNA整合到宿主染色体中，在HIV-1Tat的参与下，从位于5′长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)中的启动子表达。病毒的RNA从细胞核转运至细胞质，在Env参与下病毒mRNA在内质网上翻译，未成熟的病毒粒子开始发芽、出芽以及成熟，成熟的病毒感染下一个宿主细胞[4，8]，完成病毒的一个感染周期。

病毒对CD4+T淋巴细胞进一步感染，造成免疫缺陷。伴随着免疫缺陷的发展，病毒可以进化为使用4型CXC趋化因子受体(CXCR4)进入细胞的病毒(X4病毒)，加速疾病的进展。当血液中表达CXCR4的CD4+T细胞多于5型趋化因子CC趋化因子受体(CCR5)时，病毒则主要感染表达CCR5的CD4+T细胞(R5病毒)。被X4病毒或X4和R5病毒共同感染的CD4+T淋巴细胞，将病毒感染作用进一步扩大，这一过程将使很大一部分艾滋病毒携带者发展为AIDS患者[6]。

HIV-1的CNS感染模型认为，病毒感染早期，HIV-1就能够进入CNS。在整个感染过程中，首先HIV-1感染CD14+、CD16+单核细胞亚群，并通过在迁移的单核细胞上表达各种连接粘附分子对神经系统进行侵袭，促进单核细胞向大脑迁移，改变脑稳态，进一步影响巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞。然后，已感染的细胞释放病毒和炎症介质，感染未感染的细胞，引发神经炎症、损伤神经元和建立病毒库。接着，感染的巨噬细胞在CNS中分泌蛋白(包括HIV-1Tat、HIV-1gp120、促炎性细胞因子和趋化因子等)，这些分泌蛋白最终在BBB上建立趋化性梯度，并促使更多单核细胞进入CNS外围，放大了由单核细胞引发的神经炎症反应[9]。

HIV-1感染是多系统、多靶点的协同参与结果，针对单一靶标的治疗策略效果欠佳。因此，调控HIV-1致病因子互作蛋白将有望成为诊治HIV-1的重要手段。

2 HIV-1病毒蛋白

2.1 HIV-1病毒蛋白在细胞感染中的功能

2.1.1 HIV-1病毒蛋白的免疫功能 HIV-1病毒基因组的大小为10 kb，其中的9个基因表达16种经典蛋白质(见图1)[10]，主要的病毒蛋白有9种，它们在病毒感染免疫系统时均发挥重要作用。按照功能分为：①感染功能的病毒蛋白。病毒表面的Env为三聚体gp160，切割后为gp120/gp41，gp120可结合CD4+细胞受体和辅助受体CCR5或CXCR4，引发gp120和gp41的构象改变，导致病毒与宿主细胞融合，促使病毒进入宿主细胞[11]。②复制功能的病毒蛋白。Rev可调节对HIV-1复制起重要作用的含内含子的病毒RNA转录本的核输出机制[12]。Vpr可以增加病毒复制速率，加速细胞病变且对于感染在巨噬细胞的过程尤为重要[13]。Tat是HIV-1感染细胞产生的、由86到101个氨基酸残基(数目取决于亚型)组成的9-11kDa的病毒蛋白，其主要作用是增强病毒的复制和转录[14-15]。③转录功能的病毒蛋白。Rev以至少两种方式间接调节HIV-1转录。Vpr可以间接激活病毒启动子，促进HIV-1LTR的转录开始[16]。Tat可提高转录起始速率。病毒启动子区的起始转录效率相当低，必须通过Tat来增强转录效率与合成能力，Tat可以使病毒mRNA的产量大约提高100倍[17]。④包装功能的病毒蛋白。Gag蛋白最初合成为多蛋白前体，可以在没有其他病毒蛋白或可包装病毒RNA的情况下产生非感染性病毒样颗粒。Gag可将病毒粒子转变为成熟的具有锥形核心特征的感染性病毒粒子。在HIV-1复制的后期，Pr55gag病毒结构蛋白前体被病毒蛋白酶(PR)切割成四种主要产物：基质(MA，p17)、衣壳(CA，p24)、核衣壳(NC，p7)和C-末端p6结构域。PR、转录酶(RT)和整合酶(IN)病毒酶由pol编码[18]。在没有gRNA结合的情况下，Gag足以驱动病毒样颗粒的组装[19]。⑤辅助功能的病毒蛋白。Nef是一种在HIV-1感染早期产生的N末端豆蔻酰化的小型病毒辅助蛋白[17]。Nef作为一种致病性因子，可有效的增强病毒复制。Nef缺陷型的艾滋病病情进展非常缓慢，但病毒仍能完成复制过程[20]。Vpu是一种含81个氨基酸残基的寡聚整合膜蛋白，在病毒与受体结合和降解过程中发挥重要作用[17]。Vif主要是抵御宿主细胞DNA编辑胞苷脱氨酶APOBEC3G(A3G)的抗病毒作用[21]。

2.1.2 病毒蛋白的中枢神经功能 HIV感染会破坏BBB完整性，引起细胞紧密连接表达改变、跨屏障细胞转运作用增加，继而引起神经病变，参与此过程的两种主要蛋白质是gp120和Tat，此外其他蛋白也参与其中。

gp120可导致神经元功能障碍，促进病毒复制。病毒包膜Env或表面糖蛋白gp120靶向结合于CD4+辅助T细胞和单核细胞上的糖蛋白CXCR4和CCR5，致使病毒进入细胞，被感染的细胞穿过血脑屏障，进入大脑。HIV-1感染的单核细胞/巨噬细胞会感染驻留的小胶质细胞，并通过释放gp120进一步感染小胶质细胞和星形胶质细胞，gp120通过与Tat一样的吸附内吞作用穿过血脑屏障。大脑中，gp120既对神经元有直接神经毒性，也具有通过增加炎症性细胞因子的产生而增加BBB通透性的间接作用[22-23]。

Tat具有细胞毒性和促炎性。Tat能刺激小胶质细胞合成潜在的神经毒性分子、控制cAMP水平、细胞内钙浓度和离子通道的分子表达。Tat还可通过多种途径引起神经毒性，比如通过上调粘附分子来破坏中枢神经系统的先天免疫反应(单核细胞与星形胶质细胞的黏附增加作用有关)。在脑内皮细胞内，Tat增加趋化因子受体的表达、诱导细胞因子释放、引发氧化应激、诱致单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的释放并促进免疫细胞透过BBB。在体外和体内模型中，Tat可以通过多种信号途径介导细胞紧密连接蛋白的表达并影响BBB的屏障功能，同时它还可与G蛋白偶联受体(GPCR)相互作用[22-23]。HIV-1感染中枢系统时，gp120和Tat均可影响BBB的屏障功能，引发神经毒性。

Vpr促进非活化T细胞被HIV-1感染，并在某些HIV-1感染患者的CNS中观察到Vpr蛋白可能引起神经元损伤甚至凋亡[24-25]。HIV-1和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)中的Nef可通过产生IFN-γ诱导蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)导致星形胶质细胞和神经细胞直接或间接死亡。星形胶质细胞表达的Nef导致大鼠的空间和识别记忆受损。HIV-1相关的痴呆症(HAD)患者的尸检结果显示，Nef在海马神经元中高表达[26]。此外，Nef和Rev在BBB断裂中起作用，产生神经毒性作用[24]。

综上，在病毒的中枢感染过程中，除了起重要作用的gp120和Tat病毒蛋白外，Vpr和Nef病毒蛋白也会引发脑部中枢的细胞凋亡或死亡，以及诱致BBB的屏障功能障碍。因此，HIV-1感染中枢神经系统也是通过多种蛋白协同作用的。

2.2 HIV-1病毒蛋白对细胞膜通道的调制

目前HIV-1病毒蛋白对细胞膜通道调制的研究主要集中于Env(gp120和gp160)、Tat以及Nef蛋白。

gp120能够增强小胶质细胞Kv1.3电流水平，上调细胞中Kv1.3的表达。gp120通过小胶质细胞的Kv1.3刺激小胶质细胞产生神经毒素，从而导致神经元损伤，故对于减小和/或防止已感染脑部的小胶质细胞产生神经毒素、减缓神经元损伤具有潜在治疗意义[27]。在大鼠海马神经元中，gp120能够增强外向K+电流(Ik)，并上调海马神经元中Kv2.1的表达，表明gp120可能是通过上调Kv2.1引起的Ik增强，导致海马神经元凋亡[28]，为HIV-1治疗过程中产生的学习和记忆能力衰退症状或其他神经退行性疾病问题，提供潜在独特靶标。在大鼠皮层神经元中，gp120能够增加外向K+电流、诱导Kv2.1通道表达和激活，从而放大神经元Ik电流，引起神经元损伤，进一步确定了HIV-1相关的神经认知障碍(HAND)发病机理与K+通道之间的联系[29]。DellisO等[30]人发现，gp160在JurkatE6.1细胞上剂量依赖性的降低Kv1.3峰值电流，但不改变JCaM1.6(p56lck缺陷Jurkat细胞系)细胞的Kv1.3峰值电流，因HIV-1gp120/gp160可干扰T淋巴细胞中的p56lck、蛋白激酶C(PKC)和Ca2+稳态，说明p56lck是引起Kv1.3电流下降的原因。JensJ Kort等[31]人发现Nef使由内而外的U251细胞(人胶质瘤细胞)膜片(IOP)的大电导钾通道失活，但在完整的神经胶质细胞外添加Nef并不会改变钾的转运，这些Nef在神经胶质细胞中对钾通道活性的影响特点，可为后续研究Nef在HIV-1感染神经胶质细胞中的功能问题提供重要参考依据。

2.3 Tat对细胞膜通道的调制与影响

Tat是HIV-1基因表达的两种必需病毒调节因子(Tat和Rev)之一，其主要作用是增强病毒感染免疫系统过程中的复制和转录，在感染HIV-1患者的血清和CNS中均可检测到Tat，并且它可诱导多种细胞基因表达，充当神经毒性蛋白[32]。HIV-1感染的所有阶段都会引发患者疼痛，早期阶段的患者通常尚未接受抗逆转录病毒治疗，此时血浆和脑脊液中的病毒载量极高且蛋白含量较高[33]，高效抗逆转录病毒疗法可以让病毒载量降低到不可检测的水平但不能根除，随着治疗的减少，HIV-1病毒蛋白会在CNS内继续产生并且CNS内携带病毒的小胶质细胞和星形胶质细胞均可产生病毒蛋白，但后者产生病毒蛋白量较少。CNS内持续产生神经毒性HIV-1蛋白是造成感染者情感、认知和运动功能障碍的主要原因[34]，如HIV-1Tat独立发挥作用，或与其他病毒蛋白和炎性毒素协同作用可导致兴奋性神经元损伤或死亡。因此，HIV-1Tat病毒蛋白与细胞膜通道相互作用的研究，在HIV-1感染的所有阶段及接受治疗与未接受治疗的患者中都具有重要意义。

HIV-1Tat对不同细胞不同膜通道的调制作用研究有诸多报道，包括大脑皮层小胶质及少突胶质细胞Kv1.3，肠神经胶质Nav1.7及Nav1.8，海马锥体神经元的L型Ca2+通道，豚鼠心肌细胞hERGK+等[35-41]。本文主要聚焦Tat对K+，Na+通道的调制作用。

Jianuo Liu等[36]研究了HIV-1Tat对小胶质细胞电流水平的调制作用，结果表明HIV-1Tat蛋白能够通过Kv1.3通道，增强小胶质细胞的外向K+电流。此外亦有研究发现，Tat可通过下调通道蛋白磷酸化增加大鼠少突胶质细胞中记录的全细胞Kv1.3电流水平[35]。这些研究证明，HIV-1Tat参与了小胶质细胞介导的神经退行性疾病及HIV-1患者的脑白质损伤机制。JoyNgwainmbi等[38]人使用电流钳评估了肠神经元的兴奋性，表明HIV-1Tat在体外或在Tat转基因小鼠中可以增强肠神经元的兴奋性，使钠通道在更负的膜电位下被激活。Tat能够增强肠神经元对吗啡的敏感性并且显著增加胃肠道对吗啡的敏感性，为需要接受阿片类药物治疗的HIV-1患者提供参考[40]。这些研究表明，Tat通过调节钠通道增加肠神经元的兴奋性，Tat可能是HIV-1患者的胃肠动力障碍和腹泻症状增加的原因之一[38]。

3 小结

目前AIDS依然是目前全球公共卫生领域的重大威胁之一。截至2018年，有近62%的感染者在接受抗逆转录病毒治疗(www.unaids.org)，近年来新发艾滋病感染者与死亡率有所下降，但这些治疗手段依然无法治愈疾病。同时治疗过程中依然存在诸多问题，寻找新手段新靶点以及改善这些问题至关重要。在HIV-1的免疫系统和中枢神经系统的感染机制中，其病毒蛋白扮演着至关重要的角色，针对它们的研究，有利于完善临床现有的治疗手段。然而，相关问题报道中，依然存在局限性，对于某些HIV-1的病毒蛋白与细胞膜通道调制的研究仍是空白。本文对HIV-1病毒蛋白在细胞感染过程中的作用以及对细胞膜通道调制的综述，可为AIDS治疗寻找更多靶点与策略提供些许思路。