植物乳杆菌DMDL 9010培养基优化及其安全性评价

黄燕燕 何嘉敏 赵 珊 林钟培 周钦育 刘冬梅

（华南理工大学食品科学与工程学院 广州510640）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类在人和动物消化系统中常见且摄入一定量后对宿主健康有益的微生物[1]。其中，植物乳酸菌被大量应用于发酵产品中，所应用的菌株具有降低胆固醇[2]、降血糖[3]、抗菌消炎[4]、提高人体免疫力[5]等益生保健功能。植物乳杆菌已成为国内外研究热点之一。近年来，植物乳杆菌的高密度培养研究快速发展，而其工业应用仍处于起步阶段。目前，工业上常用MRS 培养基作为发酵培养基，不少学者研究了添加缓冲盐和化学中和剂以促进乳酸菌生长的方法，培养的菌液浓度还不高。林巧[6]对具有高活力的植物短乳杆菌JCBY-1 培养基进行Box-Behnken 优化试验，在MRS 基础培养基中添加蛋白胨1.01 mg/mL、酵母粉0.73 mg/mL、葡萄糖1.99 mg/mL、乙酸钠0.51 mg/mL 时，获得菌液光密度（OD600）最大值为0.273。该法既可获得较高浓度菌体，又可降低培养的成本，是一种较好的方法。

一直以来乳酸菌是公认的安全菌株。然而，近几十年来，世界各地陆续报道了多例乳酸菌与某些疾病发生相关的事件[7]，其中，乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、肠球菌属以及其它乳酸菌摄入引起相关局部或者全身感染的病例时有报道[8]。FAO/WHO 联合专家委员会于2002年提出了适用于食品用乳酸菌的安全性评价的内容和基本原则[9]。植物乳杆菌进行安全性评价包括进行体内试验和体外试验，其中体外试验包括抗药性研究、基体指标评价、有害代谢产物评价，而乳酸菌的有害代谢产物评价主要包括色氨酸分解活性、硝酸盐还原酶活性、溶血活性、氨基酸脱羧酶活性等[7]。

笔者课题组前期从泡菜水中筛选得到具有较好的降胆固醇效果的植物乳杆菌，经鉴定为植物乳杆菌DMDL 9010[2，10-12]。本研究通过向基础MRS培养基中添加碳源、氮源、生长因子进行单因素试验、Plackett-Burman 试验、Box-Behnken 试验，提高植物乳杆菌DMDL 9010 的发酵活菌数，并对其进行硝酸盐还原酶检测活性、抗生素抗性、吲哚试验、溶血活性检测、代谢产物抑菌性等特性研究，为下一步进行产业化和规模化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌DMDL 9010、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌，华南理工大学食品科学与工程学院食品质量与安全实验室保存；基础MRS 培养基，广东环凯微生物科技有限公司，酪蛋白消化物10 g/L，牛肉膏粉10 g/L，酵母膏粉4 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，乙酸钠0.5 g/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g/L，硫酸锰（MnSO4·4H2O）0.05 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.08 g/L；LB 液体培养基，硝酸盐培养基，蛋白胨水培养基配制方法见文献[13-15]；硫酸锰、硫酸镁、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、硝酸钾、碘化钾、对氨基苯甲磺酸、吲哚试剂（分析纯），广州化学试剂厂；淀粉、无水葡萄糖、细菌学蛋白胨、大豆蛋白肽、抗坏血酸、复合维生素B 片、哥伦比亚血琼脂平板（生化试剂），广州卯林试剂有限公司；其它试剂均为分析纯级别。

YXQ-LS-18SI 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-GJ-1R 超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GXZ-300D 生化培养箱，宁波东南仪器有限公司；DHG-9194A 电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 植物乳杆菌DMDL 9010 于斜面培养基中低温保存，将该菌从斜面培养基中接种到装有100 mL 种子培养基的250 mL 锥形瓶中，于37 ℃条件静置培养24 h；进行二级活化，接种体积分数为2.5%；活化好后得到种子液，于37℃条件下静置备用。

1.2.2 培养基优化

1.2.2.1 单因素试验 以基础MRS 培养基为基础，选择碳源：葡萄糖；氮源：细菌学蛋白胨、大豆蛋白肽；生长因子：抗坏血酸、复合维生素B、硫酸锰、硫酸镁等因素，37 ℃恒温静置培养18 h，考察植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数浓度（CFU/mL）。

1.2.2.2 Plackett-Burman 试验 在单因素试验基础上，利用Plackett-Burman 试验设计法，对上述影响因素进行筛选。每个因素分别取低（-1）和高（+1）两个水平，共12 个试验组合。每个处理重复3 次，取平均值即为试验结果。

1.2.2.3 Box-Behnken 试验设计方案 在Plackett-Burman 试验基础上，利用响应面分析法对植物乳杆菌DMDL 9010 培养基配方进行优化，利用Design-Expert 8.0.5b 软件，用Box-Behnken 模型建立三因素三水平数学模型。

1.2.3 安全性评价研究

1.2.3.1 硝酸盐还原酶检测试验 将活化后的菌悬液按照体积分数3%接种量接入到灭菌后的硝酸盐培养基中，37 ℃培养48 h 后先滴加5%的KI溶液10 滴，再滴加5%的淀粉溶液10 滴，充分振荡混匀培养基后，最后观察培养基颜色变化。同时制作对照组[13]。

1.2.3.2 吲哚试验 将活化后的菌悬液按体积分数3%的接种量分别接入到灭菌后的蛋白胨水培养基中，于37 ℃培养72 h 后，取出后向培养基中加入2 mL 乙醚，并充分振荡，静止片刻，向乙醚层加吲哚试剂8 滴，观察乙醚层颜色变化，同时制作对照组[14]。

1.2.3.3 耐药性评价试验

1）药敏试验 采用K-B（药敏纸片琼脂扩散法）进行药敏试验，取无菌生理盐水稀释后浓度为1.0×109CFU/mL 的菌悬液0.1 mL 涂布于MRS 琼脂培养基表面。所用的药敏纸片分别为四环素、红霉素、链霉素、氨苄西林。贴好药物纸片的平板放置30 min 以上，然后倒置平板于37 ℃恒温培养箱中，静置培养24 h。用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈大小（同时设计金黄色葡萄球菌作为质控菌株进行阳性对照）。

2）质粒提取试验 取2 mL 活化后的菌悬液，使用质粒提取试剂盒和溶菌酶，按照操作过程提取植物乳杆菌DMDL 9010 的质粒。利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴别[15]，利用图像记录分析系统，在254 nm 紫外灯照射下，观察是否有电泳条带。

1.2.3.4 抑菌试验 采用琼脂扩散法中的牛津杯法来测定菌株代谢产物的抑菌性，分别将大肠杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌用LB 液体培养基进行活化，取无菌生理盐水稀释后浓度为1.0×106CFU/mL 的菌悬液0.1 mL 涂布于LB 琼脂培养基表面，将无菌牛津杯平行放置两个于平板中，取0.2 mL 已活化好的植物乳杆菌DMDL 9010的发酵液和发酵上清液分别于牛津杯内，缓慢将平板置于37 ℃恒温培养箱，培养24 h，观察并测量抑菌圈直径大小，拍照记录。

1.2.3.5 溶血活性检测 将活化好的植物乳杆菌DMDL 9010 以及质控菌株大肠杆菌用灭菌的接菌环划线接种于哥伦比亚血琼脂平板中，于37 ℃培养48 h，同时做空白试验，观察菌落周围有无溶血圈出现，拍照记录。

1.2.4 数据处理 所有试验均重复3 次，试验结果表示为均值±标准偏差（M±SD）。采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，数据间的分析采用单因素方差分析（one way ANOVA）和Duncan 多重比较法，显著性水平均设定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 碳源对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响 分别向基础MRS 培养基中添加20，40，50，60，70，80，90，100 g/L 的葡萄糖，接种3%（体积分数）2 次活化后的植物乳杆菌DMDL 9010，于37℃静置培养16 h，测定植物乳杆菌DMDL 9010活菌数，见图1。由图1可以看出，随着葡萄糖添加量由20 g/L 提高到40 g/L，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数达到最大值为 （3.08±0.144）×108CFU/mL，继续增加葡萄糖含量至100 g/L，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数下降至 （2.21±0.007）×108CFU/mL，随后变化趋于平稳。葡萄糖含量较低时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数随着葡萄糖含量的提高而增多；当达到一定阶段时，又随着葡萄糖含量的提高而下降。葡萄糖的含量较高时可以抑制乳酸菌的生长。这种现象可能是由于植物乳杆菌DMDL 9010 具有反馈抑制体系，不同菌株存在不同单糖转运与转化系统，这与司天召等[16]的研究结果相类似。

图1 葡萄糖添加量对植物乳杆菌DMDL 9010活菌数的影响Fig.1 Effect of glucose addition on viable count of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

2.1.2 氮源对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响 分别向基础MRS 培养基中添加10，15，20，25，30，35，40 g/L 的细菌学蛋白胨或0，5，10，15，20，25，30 的大豆蛋白肽，接种3%体积分数2 次活化后的植物乳杆菌DMDL 9010，于37 ℃静置培养16 h，测定植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数，见图2。由图2a 看出当细菌学蛋白胨添加量为25 g/L 时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数最多且为（2.885±0.23）×108CFU/mL，在细菌学蛋白胨添加量超过25 g/L 时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数降低，说明过多的氮源会产生底物抑制作用，不利于其生长。由图2b 看出大豆蛋白肽添加量为5 g/L 时，获得植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数最多，为 （3.225±0.16）×108CFU/mL，此时植物乳杆菌DMDL 9010 的生长状况比无添加大豆蛋白肽的组别好。大豆多肽是大豆蛋白经过蛋白酶水解制得的短肽类混合物，植物乳杆菌DMDL 9010 可直接利用小分子的多肽或氨基酸进行生长代谢，促进菌体的生长繁殖和产酸[17]。当大豆多肽的添加量过多时，菌体利用大豆多肽作为营养物质已经达到极限。这与赵玉鉴等[18]的结论一致，把大豆蛋白胨作为氮源加入有利于植物乳杆菌DMDL 9010 的增殖。

2.1.3 生长因子添加量对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响 分别向基础MRS 培养基中添加0，0.01%，0.02%，0.03%，0.04%，0.05%的VC或0.05，0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 g/L的硫酸锰，或0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 g/L 的硫酸镁，接种3% （体积分数）2 次活化的植物乳杆菌DMDL 9010，于37 ℃静置培养16 h，测定植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数，见图3，由图3a 可知，当加入0.01%VC 时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数达到最多，为（3.1±0.12）×108CFU/mL，此时植物乳杆菌DMDL 9010 生长状况比空白组好，且具有显著性差异（P＜0.05），随培养基中VC 含量的增加，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数变化趋于稳定。这与邱火琴等[19]的结论一致，VC 对于植物乳杆菌DMDL 9010 生长具有促进作用。由图3b 可知，当硫酸锰添加量为0.15 g/L 时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数显著增多（P＜0.05），为（4.7±0.14）×108CFU/mL，这与杨加怀[20]的结论一致。随着添加的硫酸锰含量增加，获得活菌数逐步降低，甚至要低于未优化的基础MRS 培养基，说明加入过多硫酸锰，对植物乳杆菌DMDL 9010 增殖有显著的抑制作用（P＜0.05）。由图3c 可知，随着硫酸镁添加量从0.2 g/L 增加至0.4 g/L 时，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数显著增多（P＜0.05），从（4.8±0.19）×108CFU/mL 上升至 （6.5±0.18）×108CFU/mL，而随着硫酸镁含量的继续增加，获得植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数逐步降低，这与杨加怀[20]认为硫酸镁对于植物乳杆菌的生长并没有显著性影响的结论不一致，可能是由于菌种的差异，或是其选择的培养基从其它途径提供了Mg2+，因而不需要额外添加硫酸镁作为生长因子。

图2 氮源添加量对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on viable count of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

图3 生长因子添加量对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响Fig.3 Effect of growth factor on the viable count of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

2.2 Plackett-Burman 试验结果分析

当基础MRS 培养基中分别添加葡萄糖40 g/L，细菌学蛋白胨25 g/L，大豆蛋白肽5 g/L，抗坏血酸0.01%，硫酸锰0.1 g/L，硫酸镁0.4 g/L 时，获得的菌液是各自单因素优化试验组别中活菌数含量最高的。因此选择这几个浓度作为基准，进行Plackett-Burmen 试验和Box-Behnken 优化试验。

利用Design Expert 8.0.5 软件对上表中的数据进行分析，结果如表2。

由表3可知，在促进植物乳杆菌DMDL 9010生长方面，抗坏血酸、大豆蛋白肽、硫酸锰的贡献度较高，分别为15.09%，13.64%和6.99%，其它几个因素的贡献值均不高于5%。结果表明，在这6种促进因子中，加入抗坏血酸、大豆蛋白肽、硫酸锰，对植物乳杆菌DMDL 9010 生长起促进作用，且抗坏血酸、大豆蛋白肽的贡献值远远高于其它的因素，硫酸锰的贡献值虽远低于抗坏血酸和大豆蛋白肽，但仍高于其它的几种因素。因此，选择抗坏血酸、大豆蛋白肽、硫酸锰作为研究对象，进行Box-Behnken 优化试验。

表1 Plackett-Burmen 试验结果表Table 1 Table of Plackett-Burmen experimental results

表2 Plackett-Burmen 试验分析表Table 2 The analysis table of Plackett-Burman experiments

2.3 植物乳杆菌DMDL 9010 培养基条件的Box-Behnken 优化

运用Design Expert 8.0.5 软件对17 组试验数据（见表3～表5）进行回归分析，由表5可知，拟合模型的P=0.0007＜0.05，决定系数R2=0.9329，说明模型与实际情况拟合良好。

将大豆蛋白肽、抗坏血酸、硫酸锰添加量3 个参数分别固定，植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数随其余两个参数变化趋势如图4、图5、图6所示。

表3 Box-Behnken 试验因素水平表Table 3 Factors and levels in response surface analysis

表4 Box-Behnken 试验结果表Table 4 The results of Box-Behnken design

表5 回归方程方差分析及显著性检验Table 5 Analysis of variance and significance tests for fitted regression equation

图4 大豆蛋白肽和抗坏血酸对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响Fig.4 Effect of soy protein peptide and ascorbic acid on the active bacteria number of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

图5 大豆蛋白肽和硫酸锰对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响Fig.5 Effect of soy protein peptide and manganese sulfate on the active bacteria number of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

图6 抗坏血酸和硫酸锰对植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数的影响Fig.6 Effect of ascorbic acid and manganese sulfate on the active bacteria number of Lactobacillus plantarum DMDL 9010

根据以上分析得知活菌数Y 对自变量大豆蛋白肽（A）、抗坏血酸（B）、硫酸锰（C）的多元回归方程：Y=40.28000+0.85000A+0.82000B+2.62000C+4.95000AB+5.30000AC-0.85000BC-5.74000A2-5.14000B2-10.05000C2，得出大豆多肽添加量5 g/L，抗坏血酸添加量0.01%，硫酸锰添加量0.1565 g/L，得出理论植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数最大值4.05×1010CFU/mL，以此条件做验证试验，得到植物乳杆菌DMDL 9010 活菌数为3.88×1010CFU/mL，与理论值接近。

2.4 安全性评价试验

2.4.1 硝酸盐还原酶检测试验 植物乳杆菌DMDL 9010 的硝酸盐还原酶试验结果培养基浑浊且为黄色，说明该菌在增殖过程中表现为阴性反应，植物乳杆菌DMDL 9010 不产生硝酸盐还原酶。有些细菌在增殖过程中会产生硝酸盐还原酶，具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐[13]。

2.4.2 吲哚试验 植物乳杆菌DMDL 9010 的试验培养基浑浊且乙醚层为无色，说明该菌在增殖过程中的表现为阴性反应，植物乳杆菌DMDL 9010 不产生色氨酸酶。细菌含有色氨酸酶，该酶能够分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（靛基质）[7]。色氨酸酶一旦分解人体内的色氨酸就会造成人体中的色氨酸代谢异常，导致严重疾病发生。

2.4.3 耐药性评价试验 随着抗生素在临床治疗的广泛应用，乳酸菌的耐药性也越来越严重，长期摄入耐药性的乳酸菌会给临床治疗带来很大的困难，所以乳酸菌的耐药性问题成为了研究热点[21]。但是对于乳酸菌耐药性的出现并不全是问题，乳酸菌为了较好的适应环境变化而产生的自身耐药性是安全合理的。K-B 纸片扩散试验结果如表6所示，常见的4 种抗生素中对四环素、链霉素表现为安全的中敏，对红霉素、氨基西林表现为安全的高敏且均不含质粒。琼脂糖凝胶电泳试验结果见图7，植物乳杆菌DMDL 9010 的3 个平行样品泳道上面均没有条带出现，说明植物乳杆菌DMDL 9010 没有质粒存在，耐药基因不能转移到人基因组上进行表达食用较为安全。

2.4.4 溶血试验 有些细菌在增殖过程中会产生一种能与血液中的红血球发生特异性结合的物质，这种物质就是溶血素。在补体的作用下，抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行溶解反应，将抗体溶解，进而引发破坏红血球，造成集体严重的溶血反应，导致贫血等一系列反应出现[7]。溶血试验结果见图8，植物乳杆菌DMDL 9010 在血平板上培养48 h 后长出乳白色菌落且没有溶血圈，属于没有毒性的γ-溶血 （大肠杆菌为阳性对照β-溶血组）。

表6 耐药性试验检测结果Table 6 The results of resistance test

图7 质粒提取电泳图Fig.7 Plasmid extraction electrophoresis

图8 溶血活性检测结果Fig.8 The results of hemolytic activity test

2.4.5 抑菌试验 乳酸菌的代谢产物能抑制致病菌的生长，减少肠道内腐败菌产生的毒素，本试验选取了大肠杆菌（革兰氏阴性菌，G-）、单核细胞增生李斯特菌（革兰氏阳性菌，G+）和金黄色葡萄球菌（G+）作为指示菌，结果如图9和表7所示。植物乳杆菌DMDL 9010 发酵上清液对3 株指示菌的抑菌圈直径都达到了2 cm 以上，说明上清液能抑制大肠杆菌（G-）、李斯特菌（G+）和金黄色葡萄球菌（G+）的生长和繁殖，且发酵液上清液的抑菌效果优于发酵液，这与许多研究者的研究结果一致[22]，可能由于菌株对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的良好抑菌作用与乳酸菌代谢过程中能产生乳酸、醋酸有机酸和细菌素等天然抑菌物质有关，从而对病原菌起一定的拮抗作用[23]。

表7 菌株代谢产物的抑菌圈直径大小（cm）Table 7 Inhibition zone diameters of strains （cm）

图9 菌株代谢产物的抑菌性Fig.9 Determination of antimicrobial activity in solid LB medium

3 结论

1）通过单因素试验和Plackett-Burmen 试验发现大豆蛋白肽、抗坏血酸、硫酸锰对植物乳杆菌DMDL 9010 的生长影响显著（P＜0.05），其中影响大小依次为抗坏血酸添加质量分数＞大豆蛋白肽添加量＞硫酸锰添加量。

2）优化的发酵培养基配方为：在基础MRS培养基中添加5 g/L 大豆蛋白肽、0.01%抗坏血酸、0.1565 g/L 硫酸锰时，此时理论预测植物乳杆菌DMDL 9010 的预测菌体浓度为4.05×1010CFU/mL。对所获得的培养基配方进行验证试验，实际菌体浓度为3.88×1010CFU/mL。

3）通过对植物乳杆菌DMDL 9010 的安全性评价可知，有害代谢产物检测结果均为阴性；常见的4 种抗生素中对四环素、链霉素表现为安全的中敏，对红霉素、氨基西林表现为安全的高敏且均不含质粒；可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌的增长且不会产生溶血现象。通过响应面法优化最佳培养条件及安全性评价研究，为下一步工业化及规模化生产奠定基础。