日本血吸虫7 d童虫cDNA文库构建及免疫筛选

2020-04-02韩宏晓傅志强彭金彪林矫矫

中国动物传染病学报 2020年2期

韩宏晓，洪炀，傅志强，彭金彪，林矫矫

（1.中国农业科学院上海兽医研究所农业农村部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241；2.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海201109）

日本血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病，目前血吸虫病的防治主要依赖于抗血吸虫药物吡喹酮的使用，但存在对童虫药效差、不能预防重复感染和潜在耐药性风险等问题[1]。当前我国血吸虫病防控已从疫情控制转入疫情消除阶段，建立更为灵敏、特异和可用于早期感染诊断的技术，是做好血吸虫病消除工作的迫切需求[2]。童虫是血吸虫在终宿主体内早期发育的虫体阶段，血吸虫童虫阶段cDNA文库构建、免疫源性相关基因的筛选及重要童虫阶段差异表达基因的功能分析等研究，对筛选血吸虫早期诊断抗原分子和疫苗候选分子等都具有重要意义[3-4]。

本研究构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库，利用日本血吸虫感染10 d和42 d的小鼠血清筛选该文库，获取感染10 d的抗血清特异阳性克隆，对阳性克隆进行测序验证和分析，为加深理解日本血吸虫的生长发育机制，并对血吸虫早期诊断抗原分子和疫苗候选分子的发现提供新信息。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和酶 Trizol试剂购自Invitrogen公司；cDNA文库构建试剂盒SMARTTMcDNA Library Construction Kit购自Clontech公司；Gigapack®ⅢGold Packaging Kit购自Stratagene公司；HRP-羊抗鼠IgM酶标二抗购自Sigma公司；IPTG、X-gal等分子生物学试剂购自Promega公司；硝酸纤维素膜购自Whatman公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物和血清新西兰白兔（雄性，2.5～3.0 kg）购自上海罗泾飞达实验动物养殖场；BALB/c小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供；新西兰白兔以腹部贴片法分别感染15 000条血吸虫尾蚴，在感染后7 d剖杀，以肝门静脉灌注法收集日本血吸虫童虫备用；日本血吸虫感染小鼠的10 d和42 d血清由本实验室制备。

1.3 日本血吸虫7 d童虫总RNA的提取和纯化按照说明书用Trizol对新鲜收集的日本血吸虫7 d童虫提取总RNA，并使用Nanodrop对提取的RNA进行定量。以RNase-free DNase Ⅰ消化、RNA easyTMMini Kit试剂盒纯化去除基因组DNA污染。

1.4 日本血吸虫7d童虫cDNA文库的构建和鉴定在日本血吸虫7 d童虫纯化后总RNA中加入CDS Ⅲ/3'PCR primer、SMART Ⅳ Oligonucleotide、dNTP Mix后，以Primer Script Reverse Transcriptase Ⅲ反转录合成cDNA第一链；再分别加入mRNA 5'端Cap区和3'端polyA区通用引物、dNTPs和polymerase Mix合成双链cDNA。双链cDNA经蛋白酶K消化和SfiI酶切消化后过柱去除小片段cDNA；将收集的cDNA片段与λTriplEx2噬菌体的两臂连接，转化到宿主菌XL1-Blue构建包装好的初始文库。铺LB平板对初始文库进行滴度和容量的测定，蓝白斑筛选预估初始文库重组率；提取噬菌体DNA，以通用引物PCR扩增测定重组子插入片段大小。

1.5 7 d童虫cDNA文库的免疫学筛选日本血吸虫感染小鼠的10 d和42 d血清用大肠杆菌蛋白裂解液预吸收，以去除抗大肠杆菌抗体[5]。将日本血吸虫7 d童虫cDNA扩增文库稀释铺板，共铺15块板，将2张IPTG预处理的NC膜吸附每个LB平板上的噬菌斑并标记定位再将吸附噬菌斑的NC膜分别与预处理的血吸虫感染小鼠的10 d和42 d血清孵育过夜，用胎牛血清封闭、HRP-羊抗鼠IgM二抗孵育和DAB显色。比对10 d和42 d孵育的2张NC膜，筛选出10 d血清孵育的NC膜上特有阳性斑点（42 d血清孵育的NC膜上不显色的阳性斑点），并复筛3次。复筛获得的阳性克隆转化至宿主菌、扩增并提取噬菌体DNA、PCR鉴定后送测序，对获得的EST序列进行分析。

1.6 RT-qPCR法验证表达基因将筛选出来的7个差异表达基因利用在线设计软件https://www.idtdna.com/scitools设计实时定量PCR特异性引物，分别以纯化的10 d和42 d日本血吸虫cDNA作为模板，应用RT-qPCR法在ABI 7500 real-time PCR系统上按照2-ΔΔCt法对差异表达基因进行相对定量分析[6]，以日本血吸虫NADH-ubiquinone reductase基因为内参，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

2 结果与讨论

日本血吸虫生活史复杂，不同生活阶段虫体蛋白表达谱不断的发生变化，对宿主的免疫应答机制亦不同，尤其是处于早期发育阶段的童虫，因虫体小而成为宿主免疫应答的重要靶标。日本血吸虫肝期童虫是性别分化和发育的最快阶段，感染后7 d的童虫刚进入肝门静脉，虫体处于细胞分化期，开展童虫cDNA文库的构建及免疫筛选可为分离、鉴定早期童虫发育和分化相关基因提供了技术手段，对探讨血吸虫的免疫逃避机制、筛选血吸虫早期诊断抗原分子和疫苗候选分子具有重要意义[7]。

2.1 日本血吸虫7 d童虫cDNA文库构建与鉴定测定提取的日本血吸虫7 d童虫总RNAD260/D280比值为1.90，RNA浓度为520 μg /mL，纯化后其D260/D280的比值为1.98，RNA浓度为345 μg/mL。合成双链cDNA阶段对双链cDNA的合成循环数进行筛选分析，发现19个循环合成效率最好。构建的日本血吸虫7 d童虫cDNA文库铺平板测定其初始文库滴度为2.4106pfu/mL，对初始文库进行扩增铺平板，扩增后文库滴度为1.6×109pfu/mL，符合文库滴度要求。cDNA文库稀释后铺平板，加入IPTG、X-gal，培养9～16 h，计数平板的蓝白斑，计算cDNA文库重组率为98%。随机挑取单个噬菌斑扩增，提取噬菌体DNA，用测序通用引物T3、T7进行PCR扩增和DNA琼脂糖凝胶电泳分析，文库插入片段为0.5～3.0 kb，见图1。

2.2 日本血吸虫7 d童虫cDNA文库的免疫学筛选及分析将日本血吸虫7 d童虫cDNA扩增文库稀释铺板，每板约1000个噬菌斑的密度共铺平板15块，将2张IPTG预处理的NC膜吸附至一块平板上的噬菌斑并标记定位，后每块平板对应的2张吸附噬菌斑的NC膜分别与预处理的小鼠的10 d和42 d血清孵育、封闭、二抗孵育和DAB显色，筛选出10 d血清孵育的NC膜上特有阳性斑点50个，复筛后获得25个阳性克隆，PCR电泳和测序分析得到出17条有效EST序列。有效EST序列经NCBI比对分析，17条EST序列分别编码7个基因，见表2。他们分别为：复制蛋白（2 ESTs）、肝再生增强因子（3 ESTs）、血小板活化因子（6 ESTs）、钙调理蛋白基因（3 EST）、丝束蛋白（1 ESTs）、核糖体RNA（1 EST）和还原型辅酶脱氢酶基因（1 EST）。

图1 PCR扩增日本血吸虫7 d童虫cDNA文库插入片段分析Fig.1 PCR analysis of insert DNA fragment from 7-day schistosomula cDNA library

表2 免疫筛选获得日本血吸虫童虫阶段特异表达ESTs序列分析Table 2 Analysis of the schistosomula stage-specific expressed ESTs screened from the cDNA library

复制蛋白A（RPA）是当前国内外研究细胞DNA损伤应激反应的一个热点，RPA为真核细胞中主要的单链结合蛋白，在DNA复制和修复过程中有重要作用[8-9]。在血吸虫早期感染阶段，血吸虫遭遇新的生存、生长发育环境，复制蛋白也可能在DNA损伤应激反应中发挥作用。肝脏再生增强因子是肝细胞的生存必需的重要因子，存在于线粒体、胞浆、内质网以及胞核之中，肝脏再生增强因子由肝细胞分泌，在Kupffer细胞中通过G-蛋白耦联的受体刺激一系列免疫因子如肿瘤坏死因子、白介素-6和一氧化氮的合成[10]。血小板活化因子是一种强效生物活性磷脂类细胞因子，由白细胞、血小板、肺脏、肝脏和肾脏等多种细胞和器官产生，在血栓形成、急性炎症等病理生理过程中起重要作用[11]。日本血吸虫7 d童虫处于细胞分化期，日本血吸虫可能通过释放内源性类肝脏再生增强因子和类血小板活化因子来减少免疫应激，维持其正常生长发育，具体功能还有待进一步试验验证。钙调理蛋白为一类具有多种功能的运动相关蛋白，曼氏血吸虫研究发现钙调理蛋白可对幼虫发育、尾蚴建立感染和产卵等具有作用[12]，日本血吸虫早期童虫处于生长发育阶段，钙调理蛋白的特异性表达可能具有与曼氏血吸虫类似的功能。

2.3 免疫筛选的差异表达基因验证分析 RT-qPCR分析结果表明，免疫筛选出的差异表达基因在10 d和42 d日本血吸虫表达各异，其中复制蛋白、肝脏再生增强因子、血小板活化因子、钙调理蛋白和丝束蛋白在10 d童虫表达量显著高于42 d成虫（＞2倍），而核糖体RNA和还原型辅酶脱氢酶基因在10 d童虫和42 d 成虫表达量差异并不显著（图2）。究其原因可能源于cDNA免疫筛选方法的局限性所致，随着蛋白质组学技术的进步和发展，为精细分析不同发育阶段虫体蛋白质表达差异提供了可能。

总之，本研究成功构建了日本血吸虫7 d童虫cDNA文库，并使用日本血吸虫感染小鼠10 d和42 d血清免疫筛选该文库，获得多个日本血吸虫早期童虫阶段特异表达基因，如复制蛋白、肝脏再生增强因子、血小板活化因子、钙调理蛋白基因等，可为深入研究血吸虫早期童虫的生长发育机制，筛选血吸虫病疫苗候选分子、药物靶标和早期诊断抗原提供基础。