犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

汪 伟，辛佳亮，杜 倩，韩知晓，易驰喆，闭璟珊，曹 亮，庄忻雨，张 赫，郑 敏，孙文超,4，鲁会军,4，金宁一1,,4

（1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；2.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，长春130122；3.广西动物疫病预防控制中心，南宁530000；4.温州大学病毒学研究所，温州 325035）

犬圆环病毒（Canine circovirus，CanineCV）属于环状病毒科（Circoviridae）环状病毒属，是一种二十面体对称、无囊膜包裹的单链环状DNA病毒。CaineCV的基因组全长为2064 bp或2063 bp，包含两个主要的开放阅读框，分别编码复制酶蛋白（Rep蛋白）和衣壳蛋白（Cap蛋白）。CaineCV于2012年在美国被首次报道[1]，随后陆续在意大利、德国以及中国被发现[2-3]。Li等[4]在淋巴结和脾脏有明显炎症或血管损伤的病犬体内检测到CaineCV；在意大利，Decaro等[2]从养殖场犬繁殖舍中一条死于急性肠炎的幼犬体内检测到CanineCV。目前，CanineCV被怀疑是引起犬淋巴结肉芽肿和坏死性血管炎的致病因子，犬感染CanineCV的主要临床症状为呕吐、出血性腹泻等[2]。电镜检查和病理学剖检发现，CanineCV与圆环病毒属的其他成员相似，主要侵害淋巴细胞，这与其同属成员PCV2引起猪皮炎与肾病综合征的临床症状高度相似[5-10]。目前尚无病例或报道证实CanineCV单独感染能引起动物发病。2016年，孙文超等[3,11-12]在我国首次发现了该病毒并建立了荧光定量方法；流行病学调查结果证实，我国与欧美流行的CanineCV毒株处于两个不同的分支。目前，对CaineCV的研究尚无进展，其致病性以及致病机理不明确，尚没有针对该种病毒的ELISA检测方法和可提供完全保护的中和抗体，给临床防控带来了巨大困难。CanineCV ORF2包含813个核苷酸，编码由270个氨基酸组成的Cap蛋白[1]。本研究以该病毒的基因组序列为参考模板，通过PCR方法扩增完整的ORF2序列，并在线预测ORF2的核定位信号（nuclear localization sequence，NLS），切除了其N端由26个氨基酸序列构成的NLS，并将缺失后的ORF2序列克隆至pET-28a载体，通过大肠杆菌原核表达系统表达缺失NLS的ORF2基因，制备针对CaineCV的ELISA检测方法以及对Cap在病毒感染中的作用进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体、细胞和试剂 pGEM-T载体购自Promega公司；DL2000 DNA marker、感受态细胞DH5α、BL21（DE3）、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、琼脂糖、卡那霉素等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 引物设计 以GenBank 公布的XF16株序列（GenBank登录号：MF797786.1）为参考，设计扩增ORF2全长引物以及缺失NLS的ORF2 引物。全长上游引物Cap F（BamHI）：5'- CGGGATCCATG CGCGTACGAAGACATG-3'，d-cap上游引物F（BamHI）：5'- CGCGGATCCCAAAACAATTTC AAACTGTT -3'，下游引物R（XhoI）：5'-CCCTC GAGCAACTGTCGACCAGTTTCATAA-3'，目的片段大小为813 bp和735 bp，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.3 基因组提取 参照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

1.4 基因克隆 以基因组样品为模板，分别使用全长引物和切除NLS的引物进行PCR，设置反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；57℃退火15 s；72℃延伸45 s；30个循环；最后72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，回收纯化后连入pGEM-T载体，12℃连接12 h。连接产物转化DH5α，37℃培养1 h，将菌液均匀涂在固体LB（含卡那霉素）平板上培养12 h，挑取单菌落至LB（含卡那霉素）培养基中过夜培养，次日提取质粒并酶切鉴定，阳性克隆送至吉林省库美生物科技有限公司测序，两种正确的质粒分别命名为pT-Cap和p（1-26）T-Cap。

1.5 生物信息学分析 使用MEGA7将CanineCV的ORF2基因序列与GenBank公布的序列进行比对，使用最大似然法（ML）构建系统发生树；将测序结果上传至NLStradamus（http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/），在线预测CanineCV的ORF2的B细胞抗原表位、NLS和糖基化位点。

1.6 原核表达载体的构建 将测序正确的pT-Cap和p（1-26）T-Cap及pET-28a载体分别经XhoI和BamHI双酶切，电泳鉴定后回收酶切产物，16℃连接6 h。连接产物转化至感受态DH5α，菌液涂布在固体LB（含卡那霉素）平板上培养14 h。取单菌落至LB（含卡那霉素）培养基中培养，12 h后提取质粒并酶切鉴定，阳性质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序测序，将测序正确的样品分别标记为pET-Cap和pET-d（1-26）Cap。

1.7 重组蛋白的原核表达 将两种质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞后，涂布在固体LB（含卡那霉素）平板上培养12 h。从平板上挑取单菌落至LB（含卡那霉素）培养基中培养12 h，将母液按1∶600的比例接种到LB培养液中，培养至D600值为0.8左右，加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，取不同时间点收样。

1.8 Western blot鉴定诱导产物 样品经SDS-PAGE电泳后，通过转印将蛋白转移至膜上，常温下封闭1 h，加入Anti-His（Mouse）抗体常温下孵育2 h, 摇床上用洗涤液洗3次，加入HPR 标记的羊抗鼠二抗孵育1 h，TBST洗3次，AEC显色。

2 结果

2.1 生物信息学分析 根据GenBanck上面公布的CanineCV的序列，进行同源性比对，并构建系统发生树（图1），结果表明本次获取的CanineCV的Cap蛋白序列与2016年孙文超等[3-4]获取的JZ98/2014株处在同一分支并且同源性最高，而于意大利、美国、英国等分离的毒株同源性较低，且处在不同的分支，这表明，我国流行的CanineCV毒株与欧美各国发现的CanineCV毒株处于两个不同的进化方向，存在一定的地理隔离，但不同毒株的Cap蛋白同源性均在80%以上，这表明CanineCV的Cap蛋白保守性较高。将序列上传至网站NLStradamus上，在线预测CanineCV的Cap蛋白核定位信号、糖基化位点和B细胞表位，见图2，分析发现CanineCV的Cap蛋白N端的第2个至第26个氨基酸组成其核定位信号，这表明CanineCV的Cap蛋白可以进入宿主细胞的细胞核；糖基化位点预测结果表明CanineCV的Cap蛋白含有一个N—糖基化位点（第134位氨基酸）和两个O—型糖基化位点（第169和第238位氨基酸），其中第134位氨基酸和第238氨基酸在不同毒株之间高度保守，而第169氨基酸则表现出明显的毒株差异和地区差异；通过在线预测B细胞表位并结合蛋白亲水性及表面可能性分析，推测CanineCV的Cap蛋白有3个可能的抗原表位（表1），而在这三个表位区域CanineCV Cap蛋白的保守性较高，这有利于Cap蛋白通用型抗体的制备。

图1 基于Cap基因序列同源性构建的遗传进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on Cap gene sequence homology

表1 Cap潜在B细胞表位分析Table 1 Cap potential B cell epitope analysis

2.2 重组质粒的构建 将pT-Cap和pT-d(1-26) Cap质粒以及pET-28a载体分别经XhoI和BamHI双酶切后，琼脂糖电泳鉴定正确。胶回收纯化后4℃连接过夜，转化Trans 5α。将菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培养12 h后挑菌。挑取单菌落用液体LB培养12 h，筛选双酶切（图3）及测序均正确的阳性质粒，阳性质粒命名为pET(28a)-Cap和pET(28a)-d(1-26) Cap。

图2 GX2017与参考毒株ORF2功能区序列对比Fig.2 Alignment of amino acid sequences of encoding region of ORF2 between GX2017 and reference strain

图 3 pET-Cap 和 pET-d（1-26）Cap 双酶切鉴定Fig.3 Identification of pET-Cap and pET-d(1-26) Cap by double digestion

2.3 原核表达产物的鉴定 在转有重组质粒的BL21感受态细胞中加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG，置于37℃恒温摇床培养，7 h后取样进行SDS-PAGE电泳。将菌液超声裂解，取上清液和沉淀进行SDSPAGE分析鉴定，见图4。通过与空载体和0 h的诱导产物对比，转有pET(28a)-Cap重组质粒的重组菌不能表达带有His标签的Cap蛋白，而转有重组质粒pET(28a)-d(1-26)Cap的重组菌能正确表达带有His标签的截短的d(1-26)Cap蛋白，而条带大小约为34 kDa，与预期相符。重组d(1-26)Cap蛋白主要集中在沉淀中，表明该重组蛋白主要以包涵体的形式表达。

2.4 原核表达产物的Wstern blot鉴定 在SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上后，用Anti-His标签抗体检测带有His标签的重组d(1-26)Cap蛋白的反应原性，见图5，结果表明，重组菌的表达产物能与Anti-His标签抗体发生特异性结合，这表明带有His标签的重组d(1-26)Cap蛋白得到正确表达。

3 讨论

2012年Kapoor等[1]首次发现犬圆环病毒以来，世界各国均陆续发现并报道了犬感染CanineCV的病列，Li等[4]对多只感染了CanineCV的死亡犬进行了尸检，组织病理学分析表明病死犬均患有坏死性血管炎和多灶性出血，部分病死犬还患有淋巴结炎和肉芽肿。这与其同属成员PCV2感染的临床症状相似[6-13]，尤其与PCV2引起的猪皮炎与肾病综合征高度相似。Thaiwong 等[13]在出血性腹泻的病犬体内的淋巴坏死灶和肉芽肿病灶中检测到高滴度的CanineCV。

图4 SDS-PAGE电泳分析蛋白表达Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression

图5 d（1-26）Cap蛋白Western blot鉴定Fig.5 Western blot analysis of the d(1-26)Cap proteins

目前，美国、意大利、德国和中国等国家已陆续检测到CanineCV，并进行了全基因组序列测序。2016年，孙文超等[3-4]首次从犬血清中样品检测出CanineCV病毒，遗传进化分析表明我国报道的CanineCV毒株与欧美各国发现的毒株位于不同的进化分支[14]。目前可以确定CanineCV可导致犬出现脉管炎、坏死性淋巴结炎等。通过病理学剖检和电镜检查发现，CanineCV与圆环病毒属的其他成员相似，均以淋巴细胞为主要侵害细胞，这表明CanineCV 的致病机制与其同属成员PCV2相似[15]。CanineCV与其他病毒一起协同作用，混合感染患病动物，目前尚无证据表明CanineCV单独感染能引起动物患病。CanineCV主要其他病原体共感染，CanineCV可能会损伤宿主免疫系统，造成免疫抑制，从而为其他病原体的感染和增殖提供便利，导致临床疾病加重。已报道的CanineCV的基因组长度均为2063 bp，包含两个编码框，其中含有813 bp 碱基编码框ORF2编码病毒的衣壳蛋白Cap蛋白，其分子量大小约为30 kDa。Cap蛋白作为病毒唯一的结构蛋白，主要参与病毒基因组的保护和病毒的感染，张鑫等[5]通过构建Cap 蛋白和Rep 蛋白的真核表达质粒，通过共转染发Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位现象并持续周期，推测Rep蛋白与Cap蛋白在病毒复制过程发挥协同作用[13,15-16]。

目前研究表明，PCV2感染后可以诱导Cap蛋白和Rep蛋白的产生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性[9,17-18]，但是存在体外表达难度大、表达量低的缺点，其次针对PCV2的疫苗产生的抗体主要针对Cap蛋白，不利于临床检测区分疫苗免疫与自然感染之间的鉴别诊断问题。已有研究表明CanineCV的Cap蛋白较为保守，通过对Genbank上公布的CanineCV的Cap蛋白序列进行同源性比对分析，发现Cap蛋白的同源性较高。通过在线预测Cap蛋白的糖基化位点和B细胞表位发现，不同毒株之间的细胞表位的氨基酸序列同源性较高，这有利于制备CanineCV的通用型亚单位疫苗。

自2012年首次报道CanineCV后，欧美各国已逐步开展对CanineCV的研究，然而至今对其临床症状、病理特征、致病机制及检测手段尚无明确报道。本实验以CanineCV基因组为模板，成功扩增出病毒的Cap蛋白序列，并在线预测了其核定位信号序列、糖基化位点以及B细胞表位，同时构建了系统进化树，发现CanineCV的Cap蛋白保守性较高，但是国内流行的CanineCV毒株与欧美国家发现的毒株在进化上处于两个不同的分支，但是Cap蛋白的B细胞表位区域的氨基酸序列同源性非常高，这有利于制备CanineCV Cap蛋白的通用性抗体。随后构建了原核表达质粒pET(28a)-Cap和pET(28a)-d(1-26)Cap。SDS-PAGE分析表明Cap蛋白不能在BL21(DE3)细胞内正确表达，而缺失了核定位信号的d(1-26)Cap蛋白能在BL21(DE3)细胞内正确表达。Western blot鉴定结果表明带有His标签的重组d(1-26)Cap蛋白能以包涵体的形式在重组菌中获得高效表达。该重组蛋白可用于制备Cap蛋白的抗体，为制备CanineCV的ELISA检测试剂盒及CanineCV的亚单位疫苗奠定了基础。