巨型艾美耳球虫AMA1蛋白单克隆抗体的制备及其功能鉴定

罗伏兵 ， 刘晓冬 ， 梁 琳 ， 刘贤勇 ， 徐发荣 ， 沈光年 ， 马志军 ， 索 勋 ， 汤新明

(1.北京市动物疫病预防控制中心 ， 北京 大兴 102629 ； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 3.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

鸡球虫病是艾美耳球虫感染引起的严重危害养鸡业的寄生虫病，全球每年因球虫病造成的损失高达30亿美元[1]。以活卵囊为组分的球虫病疫苗已有数十年的应用历史，但存在影响鸡群生产性能的风险。开发安全高效的基因工程球虫病疫苗是学界研究的热点。顶膜抗原(Apical membrane antigen,AMA)是顶复门寄生虫微线体分泌的I型跨膜蛋白，由胞质区、跨膜区和胞外区组成。AMA1蛋白在顶复门原虫中高度保守，且在子孢子阶段表达水平高[2]，可能参与虫体入侵宿主细胞。巨型艾美耳球虫AMA1(EmAMA1)被认为是免疫原性较好的保护性抗原，具备开发成为亚单位疫苗的潜能[3]。因此，深入解析EmAMA1的生物学和免疫学功能具有重要意义。单克隆抗体具有高特异性、均一性以及方便生产的特点，是病原学或血清学检测技术、感染与免疫机制等研究的主要工具之一。本试验旨在构建一/多株抗EmAMA1的单克隆抗体，为EmAMA1基因功能和应用研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 巨型艾美耳球虫北京株(中国农业大学动物医学院保存)；SP2/0骨髓瘤细胞；次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)；HRP标记的山羊抗小鼠IgG；SBA Clonotyping System-HRP；BALB/c雌性小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 动物免疫 利用PCR从pSDEP2AAMA1S[4]扩增EmAMA1序列后，连接至pEt28a载体，转化至DE3菌株进行蛋白的诱导表达。获得大肠杆菌重组表达的EmAMA1蛋白，纯化后，按每只100 μg(加弗氏完全佐剂)颈背部皮下多点注射免疫4只BALB/c雌性小鼠；间隔2周后，以相同操作进行加强免疫，剂量为每只小鼠30 μg蛋白(加弗氏不完全佐剂)，加强免疫3次。于最后1次免疫后第10天，眼眶取血，分离血清。用间接ELISA方法检测小鼠血清中EmAMA1的抗体效价。

1.3 抗体检测 以纯化的EmAMA1(0.1 μg/孔)包被96孔酶标板，4 ℃过夜；每孔加200 μL脱脂乳封闭液，37 ℃封闭2 h；每孔加入小鼠血清(不同稀释度)或细胞培养上清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶20 000倍稀释)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；加入TMB底物溶液，100 μL/孔，避光显色5 min左右；每孔加入2 mol/L H2SO4，100 μL /孔，终止反应。用酶标仪测定双波长(OD450 nm，OD630 nm)，记录保存数据。

1.4 杂交瘤细胞株的建立 依据单克隆抗体的制备步骤进行。简言之，抗体滴度符合要求的小鼠(4号小鼠)，腹腔注射50 μg蛋白，进行加强免疫。免疫后3 d取小鼠脾脏，制备脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞按比例混合，按照PEG法进行细胞融合。融合完的细胞均匀倒入30个半固体培养基(含HAT)，置37 ℃、5% CO2培养箱中进行筛选培养。每个培养基分别挑93个克隆培养在铺满胸腺细胞的96孔板中，3 d后，按1.3所述方法筛检分泌特异性抗体的阳性孔，得到阳性杂交瘤细胞株；用“AMA1” “His标签”包板，做第2次筛选；将2次筛选出来的阳性细胞株进行亚类鉴定，得到IgG类型阳性杂交瘤细胞株。

1.5 单克隆抗体的纯化与鉴定 选择其中的3株阳性杂交瘤细胞按体内腹水法进行大量制备，送至北京华大蛋白质研发中心有限公司进行蛋白质纯化，SDS-PAGE以及ELISA检测抗体纯度及亲和常数，分装后冻存于-80 ℃，备用。

1.6 单克隆抗体的初步应用

1.6.1 单克隆抗体与全虫抗原的反应性检测 用巨型艾美耳球虫全虫抗原进行SDS-PAGE电泳，通过半干转印法将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后，取稀释(1∶5 000)的腹水作为一抗进行Western Blot检测，检测抗体与虫体AMA1蛋白的特异反应性。

1.6.2 单克隆抗体检测EmAMA1在巨型艾美耳球虫子孢子的表达分布 将纯化的巨型艾美耳球虫提取子孢子，取稀释(1∶2 000)的腹水作为一抗进行间接免疫荧光试验，分析单克隆抗体与虫体天然抗原的结合特性与检测EmAMA1在子孢子阶段的表达与分布。

2 结果

2.1 获得分泌抗EmAMA1抗体的杂交瘤细胞株 小鼠经重组EmAMA1蛋白免疫后，产生了针对EmAMA1的特异性抗体(见中插彩版图1)，选取4号小鼠再次进行加强免疫。取免疫后小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经第1次阳性筛选，获得47株阳性杂交瘤细胞株；经第2次阳性筛选，得到19株阳性杂交瘤细胞株。将筛选出来的19株阳性细胞株进行亚类鉴定，得到16株IgG类型阳性杂交瘤细胞株。

2.2 单克隆抗体与巨型艾美耳球虫可溶性抗原特异性反应 巨型艾美耳球虫虫体抗原经SDS-PAGE分离后，以获得的16株单克隆抗体进行免疫印迹试验。结果显示，编号为21与34的单克隆抗体与全虫抗原反应后，出现清晰的目的条带(约60 kDa)，说明这2株单克隆抗体均能够识别巨型艾美耳球虫中特异性的EmAMA1组分(图2)。

图2 利用免疫印迹试验筛选与巨型艾美耳球虫可溶性蛋白反应的抗EmAMA1单克隆抗体Fig.2 Selection of monoclonal antibodies against EmAMA1 that reacted with native E. maxima soluble antigens by Western Blot

2.3 EmAMA1在巨型艾美耳球虫子孢子的表达分布 为了验证获得的单克隆抗体能否识别巨型艾美耳球虫EmAMA1抗原，进行了间接免疫荧光试验。结果显示，筛选获得的16株单克隆抗体，只有编号为34和45的单克隆抗体能够识别巨型艾美耳球虫子孢子的AMA1，在顶质体和胞浆中检测到特异性的荧光信号(见中插彩版图3)。结果表明，编号为34和45的单克隆抗体与EmAMA1具有良好反应性，为研究EmAMA1蛋白的表达分布及免疫学特性提供了科学依据。

3 讨论

本文筛选获得了16株抗巨型艾美耳球虫AMA1蛋白的单克隆抗体，其中2株(编号为21和34)能够与巨型艾美耳球虫可溶性抗原发生特异性反应；2株(编号为34和45)能够用于检测EmAMA1在子孢子阶段的表达与分布。初步证实编号为34的单克隆抗体可用于后续EmAMA1基因功能和免疫学的研究。

顶复门原虫种类繁多，包括疟原虫、弓形虫、巴贝斯虫、艾美耳球虫等。与疟原虫和弓形虫相比，艾美耳球虫基因功能的研究相对滞后，其原因在于一是艾美耳球虫尚不能进行有效的体外培养，导致反向遗传操作等技术平台效率极低[5]；二是针对艾美耳球虫研究的一些工具或试剂，比如单克隆抗体等相对缺乏。已报道的研究中，艾美耳球虫单克隆抗体主要集中于柔嫩艾美耳球虫的微线体蛋白，其他细胞器或虫种的单克隆抗体极少[5-7]。巨型艾美耳球虫是7种鸡球虫中免疫原性强的虫种，经口免疫5个孢子化的卵囊即可产生免疫力[2]。研究表明，巨型艾美耳球虫AMA1蛋白为其保护性抗原之一，基于EmAMA1的DNA或重组蛋白亚单位疫苗能够为鸡群提供部分抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护力[3,5]。以柔嫩艾美耳球虫为疫苗载体表达EmAMA1的重组球虫同样能够提供一定的免疫保护力[4]。但巨型艾美耳球虫激发宿主产生的免疫应答及保护性免疫的分子机理仍不清楚。本文制备了针对EmAMA1的单克隆抗体，为研究巨型艾美耳球虫激发宿主产生免疫应答的机理提供了科学依据。

4 结论

本文筛选获得了1株抗巨型艾美耳球虫AMA1蛋白的单克隆抗体，可用于后续EmAMA1基因功能和免疫学的研究。