山东部分地区猫细小病毒、疱疹病毒、杯状病毒流行情况调查

曲雪婷 ， 王 森 ， 原昆鹏 ， 崔月瑛 ， 齐昊南 ， 孙 强 ， 张本清 ， 陶春霖 ， 尹燕博

(1. 青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ； 2. 橘子宠物医院 ， 山东 青岛 266061 ； 3. 青岛博隆基因生物工程有限公司 ， 山东 青岛 266041 ； 4. 瑞鹏宠物医院 ， 上海 杨浦 200082 ； 5. 青岛市即墨区畜牧业发展服务中心 ， 山东 青岛 266200 ； 6. 青岛市黄岛区农业局 ， 山东 青岛 266400 ；7.青岛博隆实验动物有限公司 ， 山东 青岛 266200)

猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)可以引起猫的高热、呕吐、白细胞严重减少以及出血性肠炎等症状[1]，是目前该属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒[2]。猫杯状病毒 (Feline calicivirus，FCV)可以导致猫科动物口腔和呼吸道传染病以及慢性胃肠炎等疾病[3]，该病毒对所有的猫科动物均有感染性，也有报道称可以感染犬[4]。猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus type 1，FHV-1)是一种高度接触性传染病毒，可以引起猫的急性上呼吸道感染，尤其对于幼猫，发病率高达100%，死亡率约 50%，是猫最重要的呼吸道病毒之一[5]。

目前尚无山东地区FPV、FHV-1和 FCV流行情况调查的报道。本试验用三重PCR方法，对2017年6月—2019年12月山东部分地区这3种病毒进行检测，旨在掌握这3种病毒在山东的流行情况，同时对阳性样本进行了病毒分离，为诊断试剂及疫苗研发打下了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 样本来源 本调查的380份口鼻、粪便拭子样本取自2017年6月—2019年12月山东部分地区的流浪猫、养猫场、猫咖、宠物收容所及宠物医院等。将样本放于装有0.5 mL 灭菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的离心管中，充分混合，4 ℃保存，24 h之内完成检测。

1.2 主要试剂 TRIzol、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×Mix，均购自宝日医生物科技有限公司；DEPC-treated Water，购自Ambion公司；DMEM培养基、胰酶，均购自Hyclone公司；TranSerum HQ Fetal Bovine Serum，购自北京全式金生物技术有限公司；Penicillin-Streptomycin for Cell Culture，购自北京索莱宝科技有限公司；PCR 基因扩增仪，购自杭州博日公司；JY04S-3C型凝胶成像仪、JY-SPFT型核酸电泳槽、电泳仪JY600E型，均购自君意东方公司；超速离心机，购自Thermo公司；-80 ℃冰箱，购自海尔集团。

1.3 检测方法 本调查中所有样本均采用TRIzol方法提取RNA后反转录为cDNA，根据王翀等[6]建立的三重PCR方法进行病毒检测，引物序列见表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 多重 PCR 引物序列Table 1 Multiple PCR primer sequences

1.4 病毒的分离和鉴定 将检测阳性的样本进行病毒分离。待CRFK细胞密度约60%后，弃培养液，按培养液体积的1/10加入待分离的样本，37 ℃吸附1 h后，加入含1%胎牛血清、1%双抗的 DMEM 维持液，于 37 ℃静置继续培养2～3 d，逐日观察有无细胞病变，将细胞培养物连续盲传3代，如不出现病变则弃去。细胞出现病变后反复冻融3次，用上述三重PCR方法进行鉴定，-80 ℃保存。

2 结果

2.1 PCR检测 从380份猫拭子样本中共检出FPV阳性样本106份，平均PCR检出阳性率为27.9%，结果见表2。由表2可知，济南地区的PCR检出阳性率最高为48%，其次是德州地区为35.3%，青岛地区和威海地区接近，分别为18.1%和18.4%，烟台地区最低为6.5%。FHV-1阳性样本19份，平均PCR检出阳性率为5%，由表2可知各地区差别不大，均处于较低的水平。FCV阳性样本51份，平均PCR检出阳性率为13.4%，由表2可知德州地区最高为18.1%，烟台地区最低为6.5%，其他地区相差不大。

表2 PCR检测结果Table 2 PCR detection results

2.2 不同来源样本各病毒的PCR检测 结果见表3。由表3可知，FPV最高PCR检出阳性率来源于宠物医院，为43.8%，其次是养猫户为32.6%，并且FPV的PCR检出阳性率明显高于另外2种病毒。FHV-1最高PCR检出阳性率来自养猫户，为6.9%，是3种病毒中感染率最低的。流浪猫FCV的PCR检出阳性率最高，为44.1%。

表3 不同来源样本3种病毒检测结果Table 3 Detection results of three viruses from samples from different sources

2.3 病毒的分离和鉴定 正常的 CRFK 细胞与接种后发生病变的 CRFK 细胞进行比较，培养 2～3 d 后，接种FCV细胞聚缩变圆呈葡萄串状分布，随后细胞开始脱落(见封三彩版图1B)，经过PCR鉴定，仅出现922 bp的条带(见图2)。接毒 FPV-1后，出现细胞肿胀圆缩，内质网空泡化，细胞粘附在单层上，随后大部分细胞开始脱落(见封三彩版图1C)，经过PCR鉴定，仅出现392 bp的条带(见图2)。接种FHV-1后出现细胞聚集，膨大变圆，随后细胞逐渐脱落(见封三彩版图1D)，经过PCR鉴定，仅出现290 bp的条带(见图2)。所有的细胞培养物均经过PCR鉴定为单一病毒感染后保存于-80 ℃用于后续研究。

图2 病毒PCR扩增Fig.2 Amplification of virus by PCRM：DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：阴性对照； 2：阳性对照； 3：FHV-1； 4：FPV； 5：FCVM:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3:FHV-1; 4:FPV; 5:FCV

3 讨论

本试验首次对山东部分地区猫FPV、FHV-1和FCV的感染情况进行了调查。2017年许楚楚等[8]对北京部分地区进行FCV和FHV-1的流行情况调查，显示FHV-1的PCR检出阳性率为26.3%，FCV的PCR检出阳性率为46.3%。2016年Fernandez等对西班牙地区有呼吸道症状和没有症状的猫进行FHV的筛查，结果显示，FHV的发生率为18.5%[9]。2019年张振江等对广西地区花鸟市场进行调查，显示FPV的PCR检出阳性率为28%[10]。本次调查的家猫中多使用针对这3种病毒的进口疫苗(妙三多)进行了免疫预防，但病原的阳性检出率仍然很高。

FPV的PCR检出阳性率为27.9%，是3种病毒中感染率最高的。2016年洪马林调查发现1岁以内的小猫FPV发病率较高，可达 83.5%，而且传染性极强，经常整窝陆续或同时发病[11]。1971年De Lahunta发表的文章显示，FPV 对3岁以上成年猫的发病率较低，仅占2%[12]。本调查发现养猫户中FPV感染率最高，尤其是3～5月龄的小猫特别易感，表现拉稀、脱水等症状。目前还没有应对FPV的特效药物和有效的治疗办法，免疫疫苗是预防该病的最佳选择。

FCV的PCR检出阳性率在FPV和FHV-1之间，为13.4%。FCV感染时，除了会伴发常见的上呼吸道症状，如打喷嚏、眼鼻分泌物增多，口腔、齿龈或舌部会出现明显的溃疡[13]。2016年Hou等对来自欧洲五国(包括法国、德国、希腊、葡萄牙和英国)的猫口咽拭子进行了调查，发现FCV的分离率在 20%以上，证明患口腔炎症的猫更易检出FCV[14]。本调查发现，FCV在流浪猫中感染率最高，原因可能是流浪猫长期处于室外环境中，与病原接触的机会较多。

本调查显示，FHV-1的PCR检出阳性率均处于较低水平，仅为5%。1998年Nasisse等收集正常及患有角膜炎的猫角膜进行PCR检测，结果显示，正常猫的角膜FHV-1的PCR检出阳性率为5.9%(1/17)，患有角膜结膜炎的猫PCR检出阳性率为55.1%(86/156)[15]。2001年Cai等对日本9个县66只出现结膜炎和上呼吸道疾病的家猫进行PCR检测发现，FHV-1的检出阳性率为10.6%[16]。同年Sykes等对澳大利亚104只家养猫进行多重RT-PCR检测，显示FHV-1的PCR检出阳性率为17.3%[17]。FHV呈间歇排毒，多数情况下潜伏在三叉神经，本调查用PCR方法检测口腔及肛门拭子，检测结果只反映采集样本的病毒核酸检出率，不能代表猫的实际感染情况。

FHV和FCV均为感染猫上呼吸道的重要病原，临床上通常根据角膜树突状溃疡等特征性症状区分这2种病毒的感染。2003年Lommer等调查发现加菲、布偶、喜马拉雅、金吉拉等具有波斯血统的猫易发生呼吸道疾病[18]。具有波斯血统的猫均属短头颅猫，但尚无研究证明短头颅性状与猫呼吸道病毒易感性相关。

目前仅有进口的妙三多疫苗用于预防这3种病毒病。本调查及部分宠物医院临床诊断显示，大量使用过该疫苗的家猫仍有发病的情况，提示我国的流行毒株可能与疫苗株存在差异。时至今日，国内还没有针对这3种病毒的特效治疗药物和疫苗上市。本试验已将本调查获得的所有PCR阳性样本进行了病毒分离和鉴定，并将对分离物进行基因序列分析，为诊断试剂研发及疫苗株的选择提供依据。