莪术二酮对脑缺血再灌注损伤小鼠认知功能及神经功能的保护作用研究

李佳娜，郭苏兰，肖水秀

(深圳市龙华区中心医院，广东 深圳 518110)

缺血性脑病是由于脑局部供血不足或中断而引起的脑组织局灶性损伤。缺血性脑病具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，严重危害着人们的健康[1-2]。临床上治疗时，往往通过药物溶栓或其它手术方法实现血管再通，然而会进一步引发脑缺血再灌注损伤[3]。目前，脑缺血再灌注损伤机制尚不明确，但有研究表明脑缺血再灌注损伤期间，血液系统有促凝倾向[4]，有研究发现抗凝药物对脑缺血再灌注损伤有较好的保护作用，但由于有严重的出血副作用，限制了临床应用[5-6]。因此，寻找有抗凝作用和出血副作用小的抗脑缺血再灌注损伤新药具有重要意义。

广西莪术(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee etC. F. Liang)为姜科姜黄属植物广西莪术的干燥根茎，是广西的道地药材[7]。莪术二酮是广西莪术的主要有效成分之一，具有明显抗血小板、抗炎和抗肿瘤作用等药理作用[8-9]。关于莪术二酮对脑缺血再灌注损伤小鼠认知功能及神经功能的作用未见相关研究报道。因此，本研究旨在探讨莪术二酮对脑缺血再灌注损伤小鼠认知功能及神经功能的保护作用，为莪术二酮的进一步研究开发提供部分实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级2月龄C57BL/c小鼠100只，雌雄各半，体重为18～22 g，购买于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0002]。动物饲养于广东省实验动物监测所SPF级屏障动物实验设施进行[SYXK(粤)2016-0122]，实验动物的使用过程中严格遵守3R原则，并得到了广东省实验动物监测所实验动物伦理委员会的批准(伦理审批号：2016005)。

1.2 主要试剂与仪器

莪术二酮(纯度≥98%，批号：13657-68-6)购于成都格利普生物科技有限公司；依诺肝素钠注射液(批号：20170321)购于法国Sanofi公司；血栓素B2(TXB2) ELISA试剂盒(批号：20170214)购于南京建成生物工程研究所；6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α) ELISA试剂盒(批号：20170313)购于南京建成生物工程研究所；一抗cAMP(货号AB：26657，批号：20161204)和一抗p-CREB(货号AB：26321，批号：20170121)购于上海碧云天生物技术有限公司。

BW-MWM101morris水迷宫：上海软隆科技发展有限公司；550酶标测定仪：日本Bio-red 公司；LG10-2.4 A型超速离心机：北京医用离心机厂；DGG-9070B电热鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；体式显微镜：深圳市西派克光学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠脑缺血再灌注损伤模型

小鼠按体重随机分为假手术组(20)、模型组(20)、低分子肝素钠组(HS组，20)、莪术二酮低剂量组(CD-L组，20)和莪术二酮高剂量组(CD-H组，20)。各组小鼠于造模当天连续灌胃给药5 d，HS组小鼠灌胃给药1 mg/(kg·d)，CD-L组和CD-H组小鼠分别灌胃给药20 mg/(kg·d)，60 mg/(kg·d)，假手术组和模型组小鼠灌胃给予等量生理盐水。参照文献方法[10]进行造模。主要方法如下：4%戊巴比妥钠麻醉小鼠，将小鼠仰卧固定于37℃手术台，剃去颈部毛发，用碘伏消毒液消毒颈部皮肤，小心暴露和分离颈部左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，先结扎颈外动脉远端，于颈外动脉远心端剪一小口，将尼龙线由颈外动脉剪口处插入，稍遇阻力停止推进并固定栓线。缺血30 min，拔出尼龙线，完成再灌注，建立小鼠MCAO模型。

1.3.2 小鼠神经功能学评分

造模24 h后，参照Longa等[11]5分制法进行行为学评分。评分方法如下：无精神损伤症状记为0分；未能完全伸展对侧前爪记为1分；向对侧转圈记为2分；向对侧倾倒记为3分；不能自发行走，意识丧失记为4分，其中0分视为造模不成功，剔除。

1.3.3 小鼠Morris水迷宫实验

参照文献[12]的实验方法，具体实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分，定位航行实验：每次实验将小鼠分别从1、2、4象限中点放入水池，记录小鼠找到平台的时间，即潜伏期，假如小鼠在1 min内还没找到平台，需引导小鼠到平台上停留20 s，并记录其潜伏期按1 min，连续4 d。第5天撤掉平台，进行空间探索实验，记录小鼠60 s内通过平台的次数以及分析小鼠寻找平台的策略。

1.3.4 小鼠脑梗死体积测定

小鼠取血后，颈椎脱臼处死小鼠，开颅取脑，生理盐水冲洗干净，-20℃冰箱内冰冻30 min，从额极向枕极方向把脑组织作冠状切片，厚度为2 mm，共4片，1% TTC染液37℃并避光孵育30 min，扫描仪扫描，使用Image-Pro Plus图像分析处理软件计算和统计脑梗死率，其中脑梗死率=梗死面积/总面积×100%。

1.3.5 脑水含量测定

小鼠开颅取脑后，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，准确称量为湿重，将脑组织放入恒温干燥箱(105℃)烤48 h，称取脑组织为干重，脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.6 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量测定

各组小鼠取血，4℃放置3 h，3000 r/min，离心30 min。吸取上层血清，按照试剂盒说明书步骤检测血清6-keto-PGF1α和TXB2含量。

1.3.7 脑组织匀浆cAMP和p-CREB的表达

BCA试剂盒检测脑组织匀浆总蛋白浓度，加入等量样品于电泳槽进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。经过转膜、封闭、孵育cAMP(1∶2000)、p-CREB(1∶1500)一抗过夜；洗膜、孵育二抗(1∶8000)、洗膜、显影，使用Image J软件半定量分析各条带灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 莪术二酮对MCAO小鼠行为学评分的影响

与假手术组比较，模型组、HS组和CD给药组小鼠行为学分数明显升高(P<0.01)。与模型组比较，HS组和CD给药组行为学分数明显降低(P<0.05)。与CD-L组比较，CD-H组小鼠行为学分数明显降低(P<0.05)，见图1。

与假手术组比较，模型组、HS组和CD给药组小鼠行为学分数明显升高(P<0.01)。与模型组比较，HS组和CD给药组行为学分数明显降低(P<0.05)。与CD-L组比较，CD-H组小鼠行为学分数明显降低(P<0.05)。

注：与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。图1 行为学评分结果Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 1 Results of behavioral evaluation

2.2 莪术二酮对MCAO小鼠学习记忆能力的影响

与假手术组比较，模型组小鼠寻找到平台的潜伏期显著延长(P<0.01)，穿越平台所在位置的次数显著减少(P<0.01)，探索策略也多采用趋向式。与模型组比较，HS组和CD给药组小鼠找到平台的潜伏期均显著降低(P<0.05)，穿越平台所在位置的次数显著增多(P<0.05)，探索策略也多采用直线式。与CD-L组比较，CD-H组小鼠找到平台的潜伏期均显著降低(P<0.05)，穿越平台所在位置的次数显著增多(P<0.05)，见表1和表2。

2.3 莪术二酮对MCAO小鼠梗死率和脑水含量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑梗死率和脑含水量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，HS组和CD给药组小鼠脑梗死率和脑含水量明显降低(P<0.05)。与CD-L组比较，CD-H组小鼠脑梗死率和脑含水量明显降低(P<0.05)，见图2和表3。

2.4 莪术二酮对MCAO小鼠血清6-keto-PGF1α和TXB2含量的影响

与假手术组比较，模型组小鼠血清TXB2含量明显升高(P<0.01)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明显降低(P<0.01)。与模型组比较，HS组和CD给药组小鼠血清TXB2含量明显降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明显升高(P<0.05)。与CD-L组比较，CD-H组小鼠血清TXB2含量明显降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明显升高(P<0.05)，见表4。

表1 各组小鼠潜伏期结果

注：与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表2 各组小鼠空间探索能力结果

注：与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

表3 脑梗死率和脑水含量结果

注：与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：A：假手术组；B：模型组；C：HS组；D：CD-L组；E：CD-H组。TTC染色图2 脑梗死体积观察Note. A, Sham operation group. B, Model group. C, HS group. D, CD-L group. E, CD-H group. TTC stainingFigure 2 Observation of cerebral infarction volume

2.5 莪术二酮对MCAO小鼠脑组织匀浆cAMP和p-CREB表达的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑匀浆cAMP和p-CREB表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较，HS组和CD给药组小鼠脑匀浆cAMP和p-CREB表达明显升高(P<0.05)。与CD-L组比较，CD-H组小鼠脑匀浆cAMP和p-CREB表达(P<0.05)，见图3。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤常常会导致不可逆的脑组织损伤，进而引起运动、认知等方面的脑功能损伤。脑缺血再灌注损伤发病机制复杂，目前尚未完全阐明，可能与氧化应激、内质网应激、自噬、细胞凋亡等密切相关[13]。但近年来研究发现脑缺血再灌注损伤常常可引起脑组织微循环障碍，通过抗凝药物防治具有较好的改善作用[14]。低分子量肝素钠是一种新型的抗凝血酶Ⅲ依赖性抗血栓形成药，药理作用与普通肝素钠基本相似。但其抗凝出血倾向较弱，使用相对安全，临床上可用于孕妇抗血栓防治[15]，故本实验选用低分子量肝素钠作为阳性对照药。莪术二酮是广西莪术的主要有效成分之一，药理学研究发现其具有明显抗血小板、抗炎和抗肿瘤作用等药理作用。此外，石红等[9]研究发现莪术二酮可显著改善老年小鼠部分肝切除术后认知功能障碍，其机制可能与其通过抑制海马组织中氧化应激，抑制NF-κB激活，减少炎症细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的释放有关。那么莪术二酮对脑缺血再灌注损伤小鼠认知功能及神经功能是否有较好的保护作用？这是本文章重点探讨的问题。

脑缺血再灌注损伤常会引起运动功能损伤，Longa 5分制法评分主要用于评价小鼠的运动功能。本研究发现模型组小鼠的行为学分数较假手术组有明显升高，差异具有统计学意义。而给与莪术二酮后，小鼠行为学分数明显降低，差异具有统计学意义，且具有剂量依赖性，提示莪术二酮可明显改善MCAO小鼠运动能力。Morris水迷宫是评价学习、记忆能力等认知能力的经典方法[16]。本研究发现模型组小鼠潜伏期较假手术组明显延长，穿越平台所在位置的次数明显减少，多采用趋向式的探索策略，差异具有统计学意义。提示模型组小鼠的认知能力受到损害，而CD给药组小鼠上述指标较模型组明显改善，呈剂量依赖性，提示莪术二酮可明显改善MCAO的认知能力。脑梗死率和脑组织病理学变化是评价模型成功和药物有效的最直接简便的观察方法[17]。本研究发现模型组小鼠脑梗死率较假手术组明显升高，脑海马齿状回神经细胞损伤严重，差异具有统计学意义，提示造模成功。而给与莪术二酮后，小鼠脑梗死率明显降低，脑海马齿状回神经细胞损伤明显改善，差异具有统计学意义，具有剂量依赖性。提示莪术二酮可明显改善MCAO小鼠神经细胞的坏死。有研究表明脑水肿是脑缺血性疾病功能障碍的主要原因，也称为该疾病最严重的并发症[18]。本研究发现模型组小鼠脑含水量较假手术组明显升高，差异具有统计学意义。而给与莪术二酮后，小鼠脑含水量明显降低，差异具有统计学意义，具有剂量依赖性。提示莪术二酮可明显减轻MCAO小鼠脑水肿程度。TXB2和6-keto-PGF1α反映机体的凝血功能的两个指标。它们分别是TXA2和PGI2的代谢产物，TXB2和6-keto-PGF1α的含量检测可间接反映血液TXA2和PGI2的水平，而调节6-keto-PGF1α/TXB2比值对血栓形成有重要影响[19]。本研究发现模型组小鼠血清TXB2含量较假手术组明显升高，而6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明显降低差异具有统计学意义。而给与莪术二酮后，小鼠血清TXB2含量明显降低，6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量明显升高，差异具有统计学意义，具有剂量依赖性，提示莪术二酮可抑制血小板聚集，从而改善MCAO小鼠微循环障碍。研究发现[20-21]cAMP/CREB/BDNF 信号通路是中枢神经维持正常生理和促进神经细胞存活、再生以及分化等有关，与学习记忆能力的形成也有密切的关系。莪术二酮给药组可明显升高cAMP和 CREB的表达水平，提示莪术二酮可能通过促进神经细胞存活、再生、分化，从而保护小鼠的认知功能。

表4 血清6-keto-PGF1α和TXB2含量结果

注：与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。

Note. Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group,cP<0.05,ccP<0.01.

注：1：假手术组；2：模型组；3：HS组；4：CD-L组；5：CD-L组。与假手术组比较，aP<0.05，aaP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,bbP<0.01；与CD-L组比较，cP<0.05，ccP<0.01。图3 各组小鼠脑组织匀浆cAMP和p-CREB Western blot电泳图Note. 1, Sham operation group. 2, Model group. 3, HS group. 4, CD-L group. 5, CD-H group.Compared with sham operation group,aP<0.05,aaP<0.01. Compared with model group,bP<0.05,bbP<0.01. Compared with CD-L group, cP<0.05,ccP<0.01.Figure 3 Western blot electrophoresis of cAMP and p-CREB in brain tissue homogenization of various groups

综上所述，莪术二酮对脑缺血再灌注损伤小鼠认知功能及神经功能有较好的保护作用，其机制可能与降低TXB2含量，升高6-keto-PGF1α、6-keto-PGF1α/TXB2比值、cAMP和 CREB的水平，从而改善MCAO小鼠微循环障碍以及激活cAMP/CREB/BDNF信号通路有关。