复方一枝蒿颗粒离乳前SD大鼠非临床安全性评价研究

田义超，周 莉，庞 聪，毛闪闪，崇立明，李 俊，李 艳，冷英莉，孙祖越*

(1.湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司，武汉 430075； 2.上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，中国生育调节药物毒理检测中心，上海 200032； 3.新疆银朵兰维药股份有限公司，乌鲁木齐 830013)

儿童处于生长发育的特殊时期，器官的生理功能尚未发育成熟，对药物的毒性敏感性与成年人具有较大差异[1-2]。近年来，儿科用药的安全性评价越来越受到重视，2017年国家食品药品监督管理局药品审评中心颁布了《儿科用药非临床安全性研究技术指导原则(征求意见稿)》[3]，对儿科用药非临床安全性评价方案的设计提供了参考依据。复方一枝蒿颗粒为抗感冒的纯中药制剂，主要组成为新疆一枝蒿、板蓝根和大青叶等，具有解表祛风、凉血解毒的作用，多年临床应用表明其对感冒的治疗具有显著疗效，在新疆具备良好的民众基础和认知度[4-5]。目前，已有文献报道复方一枝蒿颗粒对刚离乳大鼠非临床安全性评价的研究，可支持3岁以上儿童用药的临床申报[6]，为了扩大用药人群至1岁以上儿童，充分评价复方一枝蒿颗粒的安全性，本研究选取离乳前SD大鼠为研究对象，并遵照药物非临床研究质量管理规范(GLP)进行试验，为儿童用药提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD孕鼠(GD15，妊娠第15天)43只，体重360～440 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2016-002]，幼鼠160只，于PND15开始给药，体重35～50 g。饲养于湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司屏障系统[SYXK(鄂)2016-0090]，环境温度20℃～26℃，日温差≤4℃，湿度40%～70%，换气次数每小时≥15次，光照每12小时明暗交替。实验动物的使用遵循3R原则，动物使用前向本机构的动物福利伦理委员会提出申请，批准编号：IACUC(准)-2018-044。

1.2 主要试剂与仪器

复方一枝蒿颗粒干膏粉(新疆银朵兰维药股份有限公司，批号：T180422)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，湖州展望药业有限公司，批号：20170701)；戊巴比妥钠(德国默克公司，批号：CK1604BM)；血清生化与血液学检测试剂(希森美康生物科技有限公司)；凝血检测试剂(美国Instrumentation Laboratory公司)；电解质检测试剂(梅州康利高科技有限公司)；尿液检测试剂(长春迪瑞医疗科技股份有限公司)；激素检测试剂(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

BX-3010全自动生化分析仪、XN-1000IV全自动模块式血液体液分析仪(日本SYSMEX公司)；Klite8G多参数电解质分析仪(梅州康利高科技有限公司)；ACL TOP300 CTS全自动凝血分析仪(西班牙沃芬公司)；H800干化学尿液分析仪(长春迪瑞医疗科技股份有限公司)；ASP300S全自动脱水仪、RM2235轮转切片机(德国Leica公司)；Mb-Ⅱ全自动包埋仪(武汉赛尔思科技有限公司)；BX53生物显微镜(日本Olympus公司)；iMark酶标仪(美国Bio-RAD公司)；UltraFocus小动物骨密度仪(美国Faxitron公司)；JLBehv-LAG-4自发活动分析系统(上海吉量软件科技有限公司)；ZH-300B大鼠转棒式疲劳仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；1056004大鼠避暗实验视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 离乳前大鼠单次给药毒性实验

乱作为的背后，往往是扭曲的政绩观在作祟。为了能迅速树立自己的“能人形象”，充分展示自己的“治理能力”，少数干部特别热衷上项目，搞工程。而进一步梳理中央“打虎”榜单，我们还不难发现，那些“政绩项目”“形象工程”的背后，也往往隐藏着权钱交易的魅影。

图1 以5只雄性胎仔为例交叉抚育设计举例Figure 1 Examples of fostering design for 5 male juvenile rats

给药期结束及恢复期结束，各剂量组血液学和凝血指标与溶媒对照组比较均未见毒理学意义上的差异。

1.3.2 离乳前大鼠重复给药毒性实验

购入的36只孕鼠分娩后，其中20窝符合交叉抚育要求(每窝出生的幼鼠数至少4♀4♂)，将母鼠及其幼鼠进行交叉抚育分组，PND1-2仔鼠和母鼠按交叉抚育表分入各窝，各窝按照母鼠编号随机分为复方一枝蒿颗粒低、中和高剂量组(17.6、44.0和70.4 g/kg)，为药效学起效剂量的88、220、352倍)和溶媒对照组(0.5% CMC-Na)，每窝含幼鼠4♀4♂，每组幼鼠20♀20♂。幼鼠PND15开始给药，每天灌胃1次，连续28 d，给药体积20 mL/kg。每天观察动物一般症状；给药第1周隔天测1次体重，之后每周测2次；离乳后每周测2次摄食量；指定时间点进行行为学、阴道张开、动情周期、睾丸下降和龟头包皮腺裂开检测；解剖前进行眼科和尿液检查；给药结束及恢复期结束，分别剖杀2/3和1/3动物，进行血液学、凝血、血液生化、电解质、睾丸精子头计数、性激素、生长激素、骨骼系统、免疫指标、脏器重量和脏器系数等指标的检测，并剖检进行组织病理学检查。

The ideality factor of the CuInGeSe4/n-Si heterojunction is actually extracted from the slope of the linear part of ln I against the V feature with the aid of the subsequent equation[25]:

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 离乳前大鼠单次给药毒性实验

2.2.13 脏器重量及系数

2.2 离乳前大鼠重复给药毒性实验

2.2.1 一般症状观察

例3：某高校重大事项未严格依法依规进行决策，涉及金额681.9万元。某高校经校长办公会研究决定“同意启动新校区一至六饭堂和旧校区饭堂统一招标工作”，收取承包费。3年合计收取承包管理费 （折旧费）681.9万元。上述事项虽经集体讨论决定，但决策结果不符合教育部《关于进一步加强高等学校学生食堂工作的意见》第二点规定的高校内食堂的建筑设施由该高校统一提供，对承包经营都实行零租赁，免收管理费。

给药期及恢复期所有大鼠外观体征、行为活动、姿势、饮水和被毛，对外界刺激反应、腺体分泌物和呼吸状态等均正常。

自然科学类、社会科学类说明文阅读，是广东语文高职高考的一项重要考查内容，有9分的分值，以选择题的形式出现。基于七年来广东省语文高职高考的真题，笔者认为，只要掌握一定的阅读和答题方法，拿到满分并非难事，现总结出一些阅读方法和答题技巧，以供参考。

2.2.2 体重

正因如此，GE Digital的“三步走”发展策略，即GE For GE、GE For Customers、GE For World是很务实的。在逻辑上，前两步都正确，但第三步踩了“知识壁垒”的红线，“For World”哪是那么容易？这中间恐怕省略了“For Other Industries”“For USA”等重要步骤，以及为了验证和优化这些重要步骤所必需的长期沉淀与反复打磨。GE Digital多跨出去的那一步，就是导致其业务停摆的短板——知识壁垒。

高剂量组雄鼠体重第3天至第27天均低于溶媒对照组，高剂量组雌鼠体重第3天至第20天均低于溶媒对照组，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.01)，其他时间点与溶媒对照组比较无统计学差异(P>0.05)，见图2。

注：a：雄鼠体重；b：雌鼠体重；与溶媒对照组比较，**P <0.01。图2 复方一枝蒿颗粒对大鼠体重的影响Note. a, Weight of male rats. b, Weight of female rats. Compared with solvent control group,**P <0.01.Figure 2 Effect of compound Yizhihao particles on body weight of rats

2.2.3 摄食量

2.2.4 生长激素

雌雄鼠各剂量组摄食量与对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。

下次适应算法NF(Next Fit)：最简单也是最早研究的算法是NF算法。它的特点是至始至终保持一个当前打开的箱子，在要将货品装入到箱子时，查看这个货品能不能装入到当前打开的箱子，如果可以则装入。如果没有办法装进去，就新打开一个空的箱子作为当前的箱子，将货品装入。这个算法装箱的效率不高，原因是只有现在打开的箱子和空的箱可以作为选择装入货品。

雌雄鼠各剂量组生长激素与对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。

2.2.5 眼科检查

给药期结束及恢复期结束，对各组动物眼睛进行检查，未发现眼睑、结膜、角膜、瞳孔和虹膜等组织异常变化。

从表4可以看出不同入料压力下大直径旋流器的分级效果。入料压力为0.09 MPa时，旋流器溢流中小于0.125 mm粒级含量为32.46%，底流中大于0.25 mm粒级含量为67.87%，小于0.125 mm粒级含量为10.74%；旋流器溢流中细粒级含量高，底流中细粒级含量低，说明分级效果良好。

2.2.6 行为学测试

给药中期、给药期结束和恢复期结束前，分别进行平衡协调能力、自发活动和学习记忆能力测试，各剂量组行为学指标与溶媒对照组比较均未见毒理学意义上的差异。

2.2.7 生殖功能

给药期结束及恢复期结束，分别进行性激素水平(雌二醇、睾酮)检测和雄鼠睾丸精子头计数，各剂量组生殖功能指标与溶媒对照组比较均未见毒理学意义上的差异。

给药期结束，雄鼠高剂量组顶臀长和胫骨长小于溶媒对照组，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.05)，见表1。给药期结束和恢复期结束，各剂量组骨密度和骨矿含量与溶媒对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2.8 性发育标志

广汽新能源智能生态工厂于2017年9月正式开工建设，总投资47亿元，占地面积703亩（约46.9万平方米），是广汽智联新能源汽车产业园的首个项目，发挥着带动产业集聚的龙头作用。首期生产能力为20万辆/年，计划于2019年5月投产。

各剂量组雌鼠阴道张开时间、动情周期数和雄鼠睾丸下降时间、龟头包皮腺裂开时间与溶媒对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2.9 骨骼系统

社区管理者队伍整体素质的高低，直接关系到社区建设的质量，关系到社区管理科学化水平。如果社区管理者能自觉做到以身作则，勤政廉洁，必将进一步强化服务意识，更好地承担起党和人民赋予的光荣使命，为广大居（村）民服好务。

2.2.10 血液学和凝血

购入的7只孕鼠分娩后，其中5窝满足交叉抚育要求(每窝出生的幼鼠数至少5♀5♂)，选择其中3窝(每窝幼鼠体重平均值接近，且体重无统计学差异，剩余2窝淘汰)，见图1，按照母鼠的随机号分为复方一枝蒿颗粒低、高剂量组(70.4、88.0 g/kg)和溶媒对照组(0.5% CMC-Na)，每窝含幼鼠5♀5♂，见图1。幼鼠PND15开始给药，24 h内单次给药，给药体积为20 mL/kg。观察第1、2、3、5、7、10和14天动物的体重、死亡情况及毒性反应。实验过程中出现死亡的动物及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当肉眼观察组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，进行组织病理学检查。

2.2.11 血液生化、电解质和免疫

给药期结束及恢复期结束，各剂量组血液生化、电解质和免疫指标与溶媒对照组比较均未见毒理学意义上的差异。

(4)分级机分级效率与磨矿细度之间关系。分级机的分级效率越高，磨机产量和效率也越高；反之，出现过磨现象，导致磨机产量和效率降低，对后续工艺流程影响也很大。

(5)病者困剧身体痛，则谓鬼持杖殴击之，若见鬼[把]椎锁绳立守其旁，病痛恐惧，妄见之也。(东汉《论衡》)

2.2.12 尿液

给药期结束前进行尿液检测，中、高剂量组尿胆红素阳性比例高于溶媒对照组，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.01)，见表2。恢复期结束，各剂量组各尿液指标与溶媒对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。

动物死亡情况：给药第2天(24 h)高剂量组3只动物(1♂2♀)死亡。雄鼠体重：给药第2天至第14天低、高剂量组体重出现明显下降，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。雌鼠体重：给药第2天低、高剂量组体重出现明显下降，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.05)，其他时间点未见统计学差异。大体解剖：对给药第2天死亡的动物进行大体解剖，均可见胃内充满棕褐色疑似药物的液体，气管、食管和肺未见异常；对观察期结束的动物进行大体解剖，各组织脏器均未发现肉眼可见异常。在本实验条件下，SD大鼠(PND15)单次灌胃给予复方一枝蒿颗粒干膏粉的最大耐受量(MTD)为70.4 g/kg。

高原反应极可能造成儿童死亡，并且多为突发症状。急诊治疗和护理高原反应要求护理人员专业，及时，且能够根据患儿症状采取最佳的护理方案。降低反应影响程度，确保患儿健康。对高原反应急诊就诊患儿护理的具体要求如下。

给药期结束，低、中和高剂量组肝脏体比及脏脑比均高于溶媒对照组，中、高剂量组肝脏体比高于溶媒对照组，高剂量组肝脏脑比高于溶媒对照组，与溶媒对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，见表3。恢复期结束，各剂量组各脏器重量及脏器系数与溶媒对照组比较均无统计学差异(P>0.05)。

2.2.14 组织病理学检查

与溶媒对照组相比，高剂量组各脏器未见明显与受试物相关的病理改变，恢复28 d后，亦未见明显延迟性毒性病理改变。

表1 复方一枝蒿颗粒对雄鼠骨骼系统的影响

注：与溶媒对照组相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表2 复方一枝蒿颗粒对大鼠尿液指标的影响

注：与溶媒对照组相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表3 复方一枝蒿颗粒对大鼠脏器重量及系数的影响

注：与溶媒对照组相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

3 讨论

常规的非临床毒理学研究通常采用啮齿类动物(大鼠)和非啮齿类动物(犬、小型猪等)。大鼠作为实验模型具有充分的经验，拥有大量的背景数据，大鼠相应的发育阶段，可涵盖中枢神经系统、骨骼系统、生殖系统、心血管系统、肺脏系统、肾脏系统和免疫系统等靶器官的所有出生后发育阶段。同时，复方一枝蒿颗粒的药效学资料表明对模型大鼠有效[7]，根据原国家食品药品监督管理总局制定的《药物重复给药毒性试验技术指导原则》(2014年)[8]和《儿科用药非临床安全性研究技术指导原则(征求意见稿)》(2017年)[3]对动物选择的建议，本研究采用大鼠作为实验动物。

幼龄动物非临床安全性研究受多种因素的影响，最典型的是年龄，初始给药时动物的发育年龄需与儿科用药目标人群的年龄相匹配[9-10]。复方一枝蒿颗粒临床拟用人群为1岁以上幼儿，幼鼠PND15(离乳前)首次给药，此时动物年龄与临床拟用儿童年龄相当[11]。

离乳前大鼠非临床研究中窝的构成(窝内幼鼠的分配方法)有窝内设计(within litter design)、窝间设计(between litter design)、1只幼仔/性别/窝(One pup per sex per litter design)和交叉抚育设计(fostering design)。其中，交叉抚育设计为幼仔出生后，立刻由新的母鼠抚养，每窝的构成都是由其他窝的幼仔组成；新的抚育窝内，无任何同性兄弟姐妹；所有幼仔接受同样的给药处理，该设计将窝效应和遗传倾向最小化[12]，故本研究采用交叉抚育设计方法。

离乳前大鼠单次给药毒性实验：①给药第2天观察到复方一枝蒿颗粒高剂量组(88.0 g/kg)出现3只幼龄动物死亡，大体解剖胃内有药液，但肺、食管、气管未见异常，与灌胃操作失误无关，与供试品的毒性相关；低剂量组(70.4 g/kg)和溶媒对照组无动物死亡。②给药第2天低、高剂量组雌雄幼鼠体重出现明显下降，认为幼龄动物死亡和体重下降原因与大剂量给予受试物后的毒性相关。离乳前SD大鼠(PND15)单次灌胃给予复方一枝蒿颗粒的最大耐受量(MTD)为70.4 g/kg。

离乳前大鼠重复给药毒性实验：①雄鼠高剂量组第3天至第27天体重及雌鼠高剂量组第3天至第20天体重均低于溶媒对照组(P<0.01)，认为大剂量灌胃给予复方一枝蒿颗粒28 d，可减缓雌雄幼龄大鼠的体重增长。②给药期结束，雄鼠高剂量组顶臀长和胫骨长均小于溶媒对照组(P<0.05或P<0.01)，结合给药期雄鼠体重明显下降，认为灌胃给予复方一枝蒿颗粒28 d，可导致雄鼠顶臀长和胫骨长降低。③给药期结束，雌雄幼龄大鼠中、高剂量组BIL阳性率高于溶媒对照组，结合参考文献[6]，同样发现中、高剂量组动物尿液BIL阳性率偏高，但均未检测到肝组织病理学以及相关血液学和血液生化指标的异常变化。尽管BIL的变化考虑与受试物无关，但建议临床大剂量长期给予受试物时注意监测这些指标的变化。④给药期结束，雄鼠低、中和高剂量组肝脏体比及脏脑比与雌鼠中、高剂量组肝脏体比及雌鼠高剂量组肝脏脑比高于溶媒对照组(波动范围9.2%～20.2%)，结合参考文献[6]，同样发现高剂量组动物肝脏体比及脏脑比偏高，本试验血清ALT、AST等相关指标无异常，肝组织病理学亦未见明显异常，且恢复期结束肝重量和系数均可恢复，推测该变化为微粒体酶的诱导作用，即肝的适应性反应，而与受试物毒性无关。

综上所述，在本试验所设定的条件下，离乳前SD大鼠(PND15)单次灌胃给予复方一枝蒿颗粒的最大耐受量(MTD)为70.4 g/kg，重复灌胃给予复方一枝蒿颗粒28 d毒性实验的最大无毒反应剂量(NOAEL)为44.0 g/kg。