HPLC法测定乳制品中富马酸二甲酯的方法学研究

2020-03-27李顺红黄凤玲贺晓光

现代食品·上 2020年1期

李顺红　黄凤玲　贺晓光

摘要：本实验建立了高效液相色谱法测定乳制品中富马酸二甲酯。检测波长为280 nm， WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-缓冲溶液（55∶45），柱温40 ℃。氨水甲醇溶液作为提取剂、超声15 min、转速5 000 r·min-1、pH值6.0条件下测得富马酸二甲酯回收率最高，检出限为0.60 μg·mL-1，定量限为1.82 μg·mL-1，平均回收率102.05%，精密度RSD为0.053%，该方法简单、快速、准确，适用于乳制品中富马酸二甲酯检测。

关键词：乳制品;富马酸二甲酯;提取条件;高效液相色谱法

Abstract：A high performance liquid chromatography （HPLC） was established for the determination of dimethyl fumarate in dairy products. The detection wavelength was 280 nm， WondaSil C18 Chromatographic column （4.6 mm×250 mm，

5 μm）. The mobile phase was methanol-Buffer solution （55∶45）， and the column temperature was 40 ℃. The recovery of dimethyl fumarate was the highest under the condition of ammonia water methanol solution as extractant， ultrasound for

15 min， rotating speed of 5 000 r·min-1 and pH value of 6.0.The detection limit was 0.60 μ g·mL-1， the quantitative limit was 1.82 μg·mL-1， the average recovery was 102.05%， and the precision RSD was 0.053%.The method is simple， rapid and accurate， and is suitable for the detection of dimethyl fumarate in dairy products.

Key words：Dairy products; Dimethyl fumarate; Extraction conditions; HPLC.

中图分类号：TS252.7

富马酸二甲酯（DMF）是一种新型抗菌剂和防霉剂，又称霉敌。由于富马酸二甲酯对抑制霉菌、酵母菌和细菌的生长有显著效果[1]，抗菌活性几乎不受pH影响，对乳制品的防霉效果优于丙酸盐、山梨酸及双乙酸钠等酸性防腐剂，因而被广泛应用于乳制品、蔬菜、面粉、熟食、饲料及化妆品中用于防霉[2]。在常温下，富马酸二甲酯易升华，对人的眼睛、呼吸系统和黏膜有刺激作用，它可在体内转化成甲醇，对肠道、内脏等器官有毒副作用，尤其对儿童的成长发育危害极大[3]。

我国卫生部禁止在食品中添加富马酸二甲酯[4]。一些不法食品生产者为降低成本、延长产品保质期，仍然在乳制品中违法使用富马酸二甲酯，严重威胁消费者的身体健康。高效液相色谱法因具有测定成本低、操作简单、快速、准确等优点被广泛应用于食品检测中。本文对样品前处理进行单因素优化，并建立高效液相色谱法测定乳制品中富马酸二甲酯，为相关部门对乳制品的质量监控提供参考，也为人们能喝上优质的乳制品提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料。牛奶样品1号、5号、7号、8号、9号购自宁夏夏进科技股份有限公司，牛奶样品2号购自宁夏春天然乳品股份有限公司，牛奶样品3号、4号购自宁夏塞上乳业股份有限公司，牛奶样品6号购自宁夏银川平吉堡乳业厂;甲醇、乙酸为色谱纯，购自赛默飞试剂有限公司;盐酸、乙酸钠、溴化四丁基铵、氨水均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;富马酸二甲酯标准品[（DAKKS（德国进口）]，纯度99.9%。

仪器。高效液相色谱仪（型号：LC-20AT/SPD-M20A，二极管阵列检测器，日本岛津公司）;紫外/可见分光光度计（型号：TU-1810，普析通用仪器有限责任公司）;电子天平[型号：MS-105，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];離心机（型号：TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）;超声波清洗器（型号：AS3120，天津奥特恩斯仪器有限公司）;过滤真空泵（型号：AP-9925-3，天津奥特恩斯仪器有限公司）。

1.2 色谱条件

WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）色谱柱;甲醇∶缓冲溶液（55∶45）为流动相;流速1.0 mL·min-1;检测波长280 nm;柱温40 ℃;进样量20 L。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

准确移收富马酸二甲酯储备液（1.0 mg·mL-1）0.1、0.2、0.5、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，制备标准系列10、20、50、100 μ g·mL-1和200 μ g·mL-1标准工作液。以标准系列溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 样品的前处理方法建立

准确称取乳制品3 g于50 mL比色管中，加入10 mL氨水甲醇溶液（1∶20），振荡摇匀，超声15 min，待冷却到室温后，加入盐酸，调节pH至6.0，用水定容至25 mL。静置，取部分上清液于离心管中，加入沉淀剂（乙酸锌和亚铁氰化钾各3～5滴），5 000 r·min-1离心5 min。取上清液经0.45 μm滤膜过滤，备用。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

由图1知，富马酸二甲酯在280 nm处具有最大吸收峰，因此，选择280 nm作为检测波长。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

由图2知，WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱分离度比WondaSil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）更高。乳制品中含有较多杂质和大量蛋白质，所以本次选用WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作为本次试验的色谱柱。

2.2.2 流动相的确定

由图3知，当流动相为甲醇∶水（55∶45）和乙腈∶水（60∶40）时，未检测出富马酸二甲酯，乙腈∶磷酸（10∶90）的富马酸二甲酯峰与溶剂峰相比较，富马酸二甲酯的峰太小不易分辨，而流动相甲醇∶缓冲溶液（55∶45）的目标峰与溶剂中干扰峰完全分离，色谱峰突出。选择甲醇∶缓冲溶液（55∶45）为本次实验流动相。

2.2.3 柱温的确定

在280 nm波长、WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、甲醇∶缓冲溶液（55∶45）流动相及柱温40 ℃条件下，标样和样品均具有较好的分离度，故确定本次试验的柱温为40 ℃（见图4）。

2.3 定性实验

在280 nm波长、WondaSil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及甲醇∶缓冲溶液（55∶45）流动相、40 ℃柱温条件下，做定性实验。如图5所示，样品富马酸二甲酯的保留时间与标准品保留时间一致，且分离度符合要求。

2.4 标准曲线的绘制

由图6标准曲线图可知，回归方程为A=271 924X-80 426.4，R2=0.999 9。富马酸二甲酯浓度在10～200 μg·mL-1范围内与其响应值呈良好的线性关系。

2.5 样品的前处理单因素优化试验

分别以提取溶液、超声时间、离心转速、pH值等对乳制品中富马酸二甲酯回收率产生影响的几个因素作单因素试验，以各因素值为横坐标，回收率为纵坐标，绘制散点趋势图，考察各因素的变化与富马酸二甲酯加标回收率的关系

2.5.1 提取溶液的确定

选取不同提取溶液，氨水∶甲醇（1∶20）、甲醇、乙腈、氨水进行试验。按照1.3.2处理，研究提取溶液对富马酸二甲酯回收率的影响。如图7所示，当提取溶液为氨水甲醇（1∶20）时，测出的富马酸二甲酯的回收率最大，甲醇和乙腈溶液测得的回收率相对较少，氨水溶液没有测得回收率。所以试验最终选择提取溶液为氨水∶甲醇（1∶20）。

2.5.2 超声时间的确定

选取超声时间5、15、25、35、45 min和60 min为试验对象，按照1.3.2处理，研究不同超声时间对富马酸二甲酯回收率的影响。如图8所示，试验结果显示超声5～15 min，随超声时间的增加富马酸二甲酯的回收率上升，15～35 min回收率较为平稳。35～60 min开始下降。选取15 min为本次试验的超声时间。

2.5.3 离心机转速的确定

选取1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 r·min-1和10 000 r·min-1离心转速进行试验，按照1.3.2处理，研究不同转速对富马酸二甲酯回收率的影响。由图9试验结果显示，1 000～5 000 r·min-1回收率逐步增大，5 000～9 000 r·min-1回收率逐步降低，9 000～10 000 r·min-1回收率又逐步升高。5 000 r·min-1回收率最大。选择5 000 r·min-1作为本次实验的离心机转速。

2.5.4 pH值的确定

试验选取pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0为试验对象，按照1.3.2处理，考察不同pH值对富马酸二甲酯回收率的影响。如图10所示，pH值为6.0时回收率最高，选择pH值为6.0。

2.6 稳定性试验

由表1知，12 d内的RSD值为1.87%，可以在0～4 ℃避光冷藏保存12 d。

2.7 精密度试验

在已确定的色谱条件下，准确吸取富马酸二甲酯标准溶液100 μg·mL-1共6份，每份吸取0.5 mL标准溶液，测定结果见表2。RSD平均值为0.053%，小于2%，表明精度良好。

2.8 检出限及定量限试验

吸取富马酸二甲酯标准溶液100（μg·mL-1）测定，在仪器的响应值是仪器噪声的3倍时，计算最小检出限，仪器的响应值是仪器噪声的10倍时，计算定量限。

2.9 加标回收率试验

准确称取6份6#平吉堡酸牛奶样品，加入100 μg·mL-1富马酸二甲酯标准液2.00、2.50、3.00 mL各2份，按照1.3.2方法处理。计算加标回收率。由表4所示，加標平均回收率为102.05%，RSD为0.25%。

2.10 样品测定

对市场上销售的乳制品按照所建立方法进行测定，均未检测出富马酸二甲酯，实验结果如表5所示。