芪参益气滴丸对心肌梗死后大鼠血管新生的观察＊

孙国锋，涂国胜，方正旭

(南昌大学第四附属医院心内科，南昌330003)

冠心病尤其是急性心梗是严重威胁人们健康的心血管疾病之一， 目前治疗主要是通过冠脉介入术或冠脉搭桥术进行血运重建， 但多少仍有一些不尽人意之处。 近年来，血管新生已成为冠心病研究热点,特别是急性心梗后的心肌血管新生已成为研究重点。 血管新生是心肌缺血后的一种重要代偿机制， 指通过各种方法促进新生血管生成的过程[1]。 目前急性心梗的治疗性血管新生有各种促血管新生因子、干细胞等，但由于各种原因未能在临床上得到广泛应用。 近年来有研究表明一些中成药具有扩张冠脉，改善缺血心肌血液供应，降低心肌耗氧量，减小心肌梗塞范围等作用[2]。 本研究旨在观察芪参益气滴丸对梗死后大鼠血管新生的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 雄性Wistar 大鼠30 只，体重(200±20) g，由南昌大学医学院实验动物中心提供。 按随机数字表法分为3 组，即芪参益气滴丸组(实验组，10 例) 、心肌梗死组(对照组，10 例) 和假手术组(10 例) 。 芪参益气滴丸0.5g×9 袋/盒，国药准字Z030139。 由天津天士力药业公司提供。

1.2 急性心梗动物模型制作 Wistar 大鼠， 用10%水合氯醛( 按250mg/kg 剂量) 腹腔注射麻醉，无菌操作下气管切开并插管，动物呼吸机辅助呼吸。 在第四、五肋间钝性分离胸肌，暴露心脏，在左冠脉前降支中上1/3 处结扎，观察到左室前壁心肌颜色变白，局部搏动变弱，心电图有明显ST 段弓背向上抬高，心肌梗死模型制作成功。 假手术组只穿过缝线而不结扎冠状动脉。

1.3 给药方法 实验组在结扎同时予以芪参益气滴丸0.135 g/kg 溶于5ml 生理盐水灌胃，对照组和假手术组等量生理盐水灌胃，3 组均每日1 次，连续给药28d。 术后3 组均肌肉注射40 kU 青霉素预防感染。

1.4 心梗面积的测定 喂养4 周后处死大鼠，分别进行常规HE 染色和TTC 染色。 心肌梗死面积=左心室梗死区面积/左心室面积×100%。

1.4.1 HE 染色 取大鼠心尖部心肌组织，用液氮快速冷冻，置入10%的甲醛浸泡固定12h 后，沿左室长轴的中点行组织切片， 制作厚度4μm 的组织切片，去离子水冲洗1- 2min 后，苏木精染色50s，再次用去离子水冲洗1-2 min 后，置入含1% HCl 的无水乙醇中固定30s，伊红染色6-8s，去离子水冲洗1-2min 后，无水乙醇固定后石蜡包埋，取5 个不同视野观察分析。

1.4.2 TTC 染色 将切片放入37℃预热过的1%TTC 溶液中， 置于水浴恒温振荡器中，37℃避光振荡染色20min，用4%甲醛液固定24 h，观察染色结果。氯化三苯四唑（TTC 染色）肉眼观察缺血区组织呈灰白色，正常组织呈砖红色。

1.5 新生血管计数 经Ⅷ因子免疫组化染色后，心肌组织切片，计算机图像分析软件处理，测量血管数目，即心肌梗死边缘区有Ⅷ因子染色阳性，每张切片随机观察5 个视野(×200)，取均数，再根据测量窗面积可算出每平方毫米的血管数目即面密度。

1.6 统计学方法应用 全部数据用SPSS 19.0 统计软件进行处理。计量资料以（x±s）表示，多组间两两间的比较采用多重比较方差分析，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织病理形态学观察 实验组大鼠心肌坏死改变明显轻于对照组，排列较有序；对照组大鼠HE 染色病理改变明显， 心肌细胞形态模糊，排列紊乱，有胞核固缩、溶解或消失，有炎性细胞浸润；假手术组大鼠心肌组织结构基本正常，细胞排列整齐。

2.2 心梗面积的测定 和假手术组相比，实验组及对照组大鼠均可见左心室缺血区有透壁性梗死。染色后光镜下可见梗死区内纤维组织反应性增生明显， 但实验组的梗死面积明显小于对照组，2 组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。 见表1。

表1 3 组心梗面积的比较

2.3 大鼠心肌梗死周边区毛细血管密度变化 结果显示:对照组、实验组心肌毛细血管密度均显著多于假手术组(P 均<0.05);与对照组比较, 实验组心肌毛细血管密度显著增加(P 均<0.05)。 表明芪参益气滴丸可促进心肌梗死周边区毛细血管密度增加。 见表2。

表2 大鼠心肌梗死面积、梗死周边区毛细血管计数(±s)

表2 大鼠心肌梗死面积、梗死周边区毛细血管计数(±s)

注:与假手术组比较aP<0.05；与对照组比较bP<0.05

组别 心肌梗死面积(%) 心肌毛细血管密度(条/0.2mm2)假手术组(n=10)对照组(n=10)实验组(n=10)0 30.18±3.35 22.46±2.15b 1.25±0.32 3.46±0.35a 7.32±1.31ab

3 讨论

心肌血管新生疗法己成为一种新方法,对部分不接受手术治疗的患者来说可能是一种新的希望[3]。近年来我国中医药在冠心病血管新生的研究中,积累了丰富的临床经验。 很多研究发现一些中药有促进血管新生的作用。 芪参益气滴丸主要药理成分有黄芪、丹参等，中医常用于心绞痛的治疗[4]。

Notch 信号通路在促进改善心肌缺血、诱导血管新生的过程中起重要作用， 对损伤心肌起修复作用。 有学者研究表明，在心肌梗死的大鼠中，通过上调Notch 信号通路，可以促进心肌存活和血管新生，改善心功能[5]。 有研究提示宣痹通瘀方可以通过调节Notch 含量来发挥改善心肌缺血的作用，考虑与中药发挥益气化瘀、 理气通络作用相关[6]。黄芪、 丹参配伍提取物可以有效上调VEGF 及其受KDR 的表达，从而促进心肌梗死大鼠心肌组织中血管新生作用[7]。 黄芪甲苷可部分通过调控蛋白激酶D1(PKD1)-组蛋白脱乙酰酶5(HDAC5)-血管内皮生长因子(VEGF) 信号通路发挥促大鼠心肌梗死后心肌组织血管新生的作用[8]。 红景天具有促进AMI 大鼠心肌血管新生的作用， 其机制可能与上调HIF-1a、HIF-18、VEGF 表达有关[9]。芪参胶囊能够改善心肌梗死后大鼠的心功能， 减轻不利的心室重塑。 其机制与其抑制心肌细胞凋亡及促进血管新生有关。 AKT 信号通路的激活及MEK/ERK信号通路的抑制可能是芪参胶囊发挥保护作用的核心机制[10]。研究表明麝香保心丸可以促进心梗后大鼠的血管新生， 机制可能和通过上调20-HETE介导的内皮祖细胞动员和VEGF 表达有关[11]。研究证实芪参益气滴丸能减少大鼠心肌梗死面积，增加血管密度,增加mRNA 和VEGF、bFGF 的蛋白水平，PDGF-B 的mRNA 也增加[12]。还有研究表明：丹参素通过改善大鼠左室功能， 减少心梗面积来减轻心肌缺血； 缺血后新生血管形成和心肌梗死边缘区的微血管密度增加，机制和VEGF、BFGF 的表达上调有关[13]。 在以上各种信号通路中，血管内皮生长因子(VEGF)信号通路是目前研究最清楚的一个,VEGF 信号通路参与到血管新生整个过程,发挥了重要的作用。

我们实验观察到， 对照组大鼠心肌组织形态较紊乱，部分心肌细胞轮廓消失，坏死心肌组织呈现明显的纤维化，血管不完整；实验组观察到新生的血管数量较对照组增多。 假手术组心肌细胞无明显病理改变。 通过3 组心梗面积测量，3 组间的心梗面积有显著差异，P<0.05。 实验组的心梗面积显著小于对照组，P<0.05。 结果表明芪参益气滴丸有减少心梗面积的作用。 实验组的血管面密度比心肌梗死组高， 说明心梗后有代偿性血管新生发生。 结果表明芪参益气滴丸对心肌梗死组比较有显著血管新生作用，P<0.05。

芪参益气滴丸具有刺激心肌缺血区新血管生成，建立有效的侧支循环，能够改善心肌缺血，减少心肌梗死面积的作用。 本研究表明芪参益气滴丸有减少心肌梗死面积和促进血管新生的作用。本试验为临床治疗心肌梗死的新方法提供实验依据； 但是我们的不足之处是未对如何引起血管新生的机制进行更深入的研究。