CyclinD1、VEGF 及EGFR 在结直肠癌中的表达及临床意义＊

胡佳莉，陈丕峰，叶萍，张小容

（1.九江学院附属医院，九江332000；2.江西省九江市妇幼保健院儿外科，九江332000）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤， 随着生活水平的提高，高脂高蛋白食物的摄入，结直肠癌在中国的发病率和致死率显著提升， 已跃居第五位，严重威胁着人民的生命健康[1]。

导致结直肠癌发生的原因尚不明确， 世界卫生组织曾指出生活方式、 饮食或慢性炎症是诱发结直肠癌的非常重要的危险因素[2]。 近年来越来越多的研究显示细胞周期过程中癌基因的激活和抑癌基因的失活以及一连串的信号通路的改变都可能造成细胞恶性增殖、 转化从而诱导肿瘤的发生[3]。 细胞周期素D1（CyclinD1）是重要的细胞周期的调控蛋白,调节细胞周期G1 期到S 期的转化，完成对细胞周期进程的调控，是近年来确立的癌基因和原癌基因[4]。 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR） 属受体酪氨酸激酶家族成员，参与激活重要的细胞信号通路，介导细胞分化、迁移、侵袭等[5]。 而肿瘤的侵袭和转移仍然是结直肠癌患者预后差以及死亡的重要原因[6]。 血管内皮生 长 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生成因子，是肿瘤新生血管形成及生长转移的重要影响因素。 近年来应用于结直肠癌的靶向药物主要包括以EGFR 信号传导通路为靶点的药物（帕尼单抗、西妥昔单抗）和以VEGF为靶点（贝伐单抗）的2 类药物，研究者发现，靶向药物联合化疗较单一化疗可得到更好地疗效[7]。 而有学者发现CyclinD1 可以作为晚期结直肠癌患者应用西妥昔单抗的预后指标[8]。 本研究采用免疫组织化学方法检测结直肠癌中CyclinD1，EGFR 和VEGF 的表达，进一步探讨它们与结直肠癌临床病理特征的关系，为结直肠癌的诊断、治疗及预后判断提供参考指标， 同时为结直肠癌的分子靶向药物的临床应用提供数据支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料收集 2016-2019 年九江学院附属医院病理科存档的接受手术治疗的80 例结直肠癌患者的石蜡标本。 纳入标准： ⑴无其他部位的原发肿瘤；⑵术前均未接受过放疗和化疗；⑶所有病例均经组织学检查明确确诊为结直肠癌；⑷临床资料、病理资料完整。 将距离肿瘤5cm 以外的正常的肠粘膜作为对照组。 纳入研究的80 例结直肠癌患者中男47 例，女33 例，年龄22-92，中位年龄60 岁；发生在左半结肠和直肠57 例，右半结肠和横结肠23 例。 根据WHO（2010）消化系统肿瘤分类标准，其中低级别腺癌61 例，高级别腺癌19 例（低分化腺癌9 例，黏液腺癌10 例）；累及浆膜层及浆膜外（T3-T4）68 例，不超过肌层（T1-T2）12 例；有淋巴结转移30 例，没有淋巴结转移50 例。

1.2 主要试剂 兔抗人单克隆CyclinD1 抗体（克隆号：EP12）购自北京中杉金桥公司，鼠抗人单克隆VEGF 抗体（克隆号：MAB-0243）、 鼠抗人单克隆EGFR 抗体（克隆号：MAB-0196）、即用型快捷免疫组化MaxVision 试剂盒及DAB 显示试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化 免疫组化染色采用Max Vision 法，参照试剂说明书操作。 步骤：4μm 厚石蜡切片常规脱蜡水化；EDTA 缓冲液高压修复， 浓缩型一抗用抗体稀释液稀释，CyclinD1，EGFR、VEGF 的稀释度均为1:100;4℃过夜，滴加二抗，DAB 显色，复染，脱水，封固。 用PAS 液代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 CyclinD1 蛋白是定位于胞核，EGFR 蛋白主要定位于细胞膜，VEGF 蛋白主要定位于细胞浆。使用双盲法对IHC 结果进行评分。在正置显微镜下， 随机挑出5 个高倍视野来数阳性个数，IHC 染色结果评分根据前人做法[9]，根据阳性细胞数量所占百分比和染色颜色深浅进行综合评分。评分标准为两者相乘,再根据等级来评价结果。

评分标准为：无阳性结果为0 分，1%-19%得1分，20%-50%得2 分，51%-100%得3 分；颜色深浅强度按细胞着色深浅：染不上色得0 分，淡黄得1分，棕黄得2 分，棕褐得3 分。 两项得分相乘，(0-4分)就是低表达，判为阴性；（6-9 分)就是高表达，判为阳性。 染色结果由两位副主任以上职称的病理医师共同阅片。

1.5 统计学分析 采用SPSS20.0 软件进行统计学分析 样本率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 等级相关检验。 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在结直肠癌组织中的表达结直肠癌组织中CyclinD1 的表达主要在细胞核，呈黄色至棕黄色颗粒（图1）。 VEGF 主要定位在细胞浆（图2）。 EGFR 主要定位在细胞膜（图3）。 80 例结直肠癌组织中CyclinD1，VEGF 及EGFR 的阳性率分别为68.7%，66.2%，75%， 而癌旁正常组织对照组的阳性率为10%，28.7%，38.7%，CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在结直肠癌组织中的表达差异具有统计学意义（P<0.01）。

图1 CyclinD1 在结直肠癌组织中的表达

图2 VEGF 在结直肠癌组织中的表达

图3 EGFR 在结直肠癌组织中的表达

2.2 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系 结直肠癌中，CyclinD1 的表达与组织学分级和淋巴结转移有关（P<0.05，表1），随分级的增高和淋巴结转移数量增多而增高，与性别、年龄、肿瘤发生部位和浸润深度无关（P>0.05）；VEGF 的表达与肿瘤发生部位、组织学分级和淋巴结转移有关， 与性别、 年龄和浸润深度无关（P<0.05，表2）；EGFR 与性别、年龄、肿瘤发生部位、 组织学分级、 淋巴结转移和浸润深度均无关（P>0.05，表3）。

表1 CyclinD1 表达与结直肠癌临床病理特征的关系

2.3 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在结直肠癌组织中表达的相关性 在CyclinD1 表达阳性的55 例结直肠癌组织当中，EGFR 及VEGF 阳性表达例数分别是44 例（80%）与37 例（67.2%）；在CyclinD1阴性表达的25 例结直肠癌组织中，EGFR 及VEGF 阳性表达例数分别是16 例（64%）与16 例（64%）； 在CyclinD1 阳性表达的结直肠癌组织当中EGFR 阳性表达率比EGFR 阴性表达的结直肠癌组织高，但不具有统计学意义，一定程度上可以认为CyclinD1 和EGFR、VEGF 表达之间没有明显的相关性。 目前关于结直肠中CyclinD1、VEGF 和EGFR 的关联研究有限，有待进一步深入。

表2 VEGF 表达与结直肠癌临床病理特征的关系

表3 EGFR 表达与结直肠癌临床病理特征的关系

3 讨论

结直肠癌是发生在大肠的消化道肿瘤， 发病率和病死率有逐渐升高的趋势，高危年龄为50-60岁，男女发病比例约为2-3:1。 结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着国人的健康。 根据第四版消化系统肿瘤WHO 分类，结直肠癌的组织病理学类型主要分为腺癌、 腺鳞癌、 梭形细胞癌、鳞状细胞癌和未分化癌，其中，腺癌又包括了几个亚型，如筛状粉刺型腺癌、髓样癌、微乳头状癌、 黏液腺癌、 锯齿状腺癌和印戒细胞癌， 超过90%的结直肠癌为腺癌。 第四版WHO 分类在分级上还提出以腺体形成比例为基础， 传统上将结直肠癌腺癌分为高、中、低分化和未分化。 临床更多使用低度恶性及高度恶性， 因为高分化和中分化腺癌生物学相似，且重复性好[10]。 因此结合生物学行为和临床特点我们将高分化和中分化腺癌归为低级别腺癌， 而低分化腺癌和黏液腺癌归为高级别腺癌。

目前， 对于结直肠癌的传统治疗方式包括以手术切除为主再辅以化疗的综合治疗。 而对于高级别癌和某些已经发转移的结直肠癌病人来说，预后很差，传统的治疗方式预后仍不容乐观。 近年来，随着分子靶向治疗用于临床，已经应用的治疗结直肠癌的靶向药物主要有抗血管内皮生长因子（VEGF）的药物，如贝伐珠单抗；抗表皮生长因子受体（EGFR）的药物，如西妥昔单抗，靶向药物联合传统的传统的化疗在很大程度上改善了结直肠癌患者的总生存期， 然而靶向药物的局限性也越来越被发现， 例如贝伐单抗和西妥昔单抗仅仅对KRAS 野生型的转移性结直肠癌有效，而对于这两类靶向药物的选择目前没有定论[6]。 这就说明了还要其他方面的因素影响着靶向药物的疗效[11]。

CyclinD1 是细胞周期蛋白Cyclin 家族成员之一，广泛存在于真核细胞中，是高度保守的细胞周期家族蛋白。 CyclinD1 的编码基因定位在11q13上，包含5 个外显子，全长约15kb。 CyclinD1 可以和细胞周期蛋白依赖性激酶cyclin-dependent kinase（CDKs）结合，促进细胞周期从G1 到S 期的转化[4]。 在许多肿瘤中，如食管鳞状细胞癌，子宫内膜腺癌，乳腺癌，胸腺瘤,膀胱癌等均有过表达[12-14]。徐慧敏等[15]实验结果显示cyclinD1 蛋白在结直肠癌组织中的表达率为68.3%（41/60）显著高于正常组织中，其阳性率与浸润深度、淋巴转移和dukes分期相关。 而我们的实验结果表明在结直肠癌组织中CyclinD1 的表达率68.7%（55/80）高于癌旁正常组织， 与组织学分级和淋巴结转移有关 （P<0.05）,与性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度无关，结果基本是相符合的。 分化程度低且存在淋巴结转移的肿瘤组织中阳性率较高， 提示CyclinD1 的表达促进了肿瘤的发展和转移。

VEGF 是一种重要的促血管生成因子，可以通过血管内皮上的受体（VEGFR）介导的受体信号通路，从而调节血管内皮细胞的增殖和迁移。 VEGF在肿瘤组织中表达水平增高， 提示它促进肿瘤血管的生成，进而在肿瘤发生发展中起重要作用。 谷化平等[16]研究发现VEGF 表达阳性率为66.3%，高于正常肠黏膜组织，并随着Dukes 分期增高、浆膜浸润和淋巴结转移， 其表达水平亦随着显著性增高。我们的实验结果表明在结直肠癌组织中VEGF的表达率66.2%，高于癌旁正常黏膜组织，与肿瘤的部位，组织学分级和淋巴结转移有关，与浸润深度无关，这个结果跟李文婷[17]研究的结果基本一致。 近年来在结直肠癌的治疗方面，很多研究关注左右半结肠癌靶向治疗的差异上， 治疗结果研究发现抗VEGF 靶向药贝伐珠单抗高度依赖于原发瘤部位[18]，研究者在比较贝伐珠单抗和EGFR 单抗时发现在右半结肠癌， 一线使用贝伐珠单抗疗效更优[19]。我们的结果显示VEGF 的表达升高与肿瘤部位有关，且右半结肠阳性率高于左半结肠，这为临床筛选靶向药适应的病人提供了理论依据，对于实施个体化治疗有十分重要的意义。

EGFR 是酪氨酸激酶I 型受体家族成员之一，位于人体第7 号染色体的短臂， 含有28 个外显子。 一些文献研究发现结直肠癌组织中EGFR 过度表达，与肿瘤的分化程度、淋巴结转移呈正相关[20]，但也有文献提出了不同的观点认为EGFR 表达和临床病理特征之间是否具有联系,具有何种联系仍然存在争议。 我们的结果显示EGFR 表达水平与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期分级和类型无显著相关性这与王文闻[21]的结果一致。抗EGFR 靶向药物例如西妥昔单抗只对野生KRAS 患者有效， 明确KRAS 基因的突变状态对结直肠癌的治疗有重要意义。 但是，仅仅依靠KRAS 基因状态并不能完美的预测抗EGFR 靶向药物的疗效,研究者推测可能存在如EGFR 信号通路BRAF、PIK3CA突变等[7]。

结直肠癌作为常见的恶性肿瘤之一， 它的治疗一直备受关注，大约1/3 的肿瘤被认为是EGFR依赖型， 如何筛选出对EGFR 敏感的患者是癌症精准治疗的重要内容，zhang,W 等人发现CyclinD1可以作为晚期结直肠癌患者应用抗EGFR 单抗的预后指标[8]，这就提示我们CyclinD1 可能跟EGFR之间存在某种联系， 但是很可惜本实验利用Spearman 等级相关检验没有检测到两个蛋白在结直肠中具有相关性联系。 但是我们也发现在CyclinD1 阳性表达的结直肠癌组织当中EGFR 阳性表达率比EGFR 阴性表达的结直肠癌组织高。这也提示我们CyclinD1 可能对结直肠癌组织中EGFR 的表达起促进作用。 在今后临床使用EGFR靶向药时， 检测CyclinD1 蛋白的表达可能有助于筛查对EGFR 敏感的患者。 众所周知，免疫组化染色被广泛用于研究， 但它始终是一种半定量的实验方法，具有一定的不精确性，收到观察者主观感受的影响，因此，可能需要进一步扩大样本或者蛋白定量实验来探寻CyclinD1、VEGF 和EGFR 之间的关系。