一测多评法同时测定解郁胶囊中9 种成分

2020-03-27靳晓峰魏谭军马伟丽余晓晖

中成药 2020年3期

靳晓峰魏谭军马伟丽 ∗余晓晖

（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730000； 2.甘肃中医药大学，甘肃兰州730000； 3.达州市中西医结合医院，四川达州635000）

解郁胶囊为甘肃中医药大学附属医院研制的医院制剂（甘药制字Z2016005），是由丹参、柴胡、石菖蒲、郁金、白芍等14 味药材加工而成的中成药，具有养心宁心、疏肝解郁的功效，临床上主要用于心悸不宁、情绪低落、咽有梗阻感、烦躁易怒、少眠多梦、善叹息、反应迟钝、胁肋胀痛等症状的治疗［1-2］，可明显改善抑郁模型大鼠行为学异常，增加脑内单胺递质水平［3］，并且无明显急性毒性反应［2］；联合帕罗西汀片治疗抑郁症时能明显提高临床疗效，不良反应较单用西药低［1］。

中成药复方制剂所含成分复杂，故多指标质量控制模式已广泛应用于其质量监控中，但该方法存在对照品不稳定、价格昂贵等不足。一测多评法利用制剂中所含成分间存在的特定函数关系，通过测定1 种稳定易得、价格低廉的成分含有量，来实现多种成分含有量的同时测定，有效地解决了待测成分不稳定、对照品使用量大、检验成本高的难题，已得到了广泛应用。因此，本实验采用该方法同时测定解郁胶囊中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA的含有量，以期实现该制剂多指标质量评价模式。

1 材料

Agilent 1200 型液相色谱仪（美国Agilent 公司）；LC-2010 型液相色谱仪（日本岛津公司）；AB135-S 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

芍药苷（110736-201842，纯度97.4%）、柴胡皂苷a（110777-201711，纯度91.1%）、柴胡皂苷d（110778-201711，纯度 95.8%）、丹酚酸 B（111562-201716，纯度 94.1%）、丹参酮ⅡA（110766-201721，纯度99.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷对照品（39011-91-1，纯度98.0%）购自成都曼思特生物科技有限公司；芍药内酯苷（39011-90-0，纯度97.0%）、苯甲酰芍药苷（38642-49-8，纯度98.0%）、丹参素（76822-21-4，纯度98.0%）对照品均购自上海纯优生物科技有限公司。解郁胶囊（每粒重0.5 g，批号171215、180629、190123）购自甘肃中医药大学附属医院。乙腈为色谱纯；磷酸、甲醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Extend C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～12.0 min，15.0% A；12.0～29.0 min，15.0%～36.0% A；29.0～37.0 min，36.0%～51.0% A；37.0～56.0 min，51.0%～84.0%A；56.0～65.0 min，84.0%～12.0%A）；检测波长230 nm（0～29.0 min，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷）［4-6］、210 nm（29.0～37.0 min，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d）［7］、280 nm（37.0～65.0 min，丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA）［8-11］；体积流量0.9 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备精密称取氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品适量，70% 甲醇稀释成每1 mL 分别含0.278、1.252、2.344、0.198、0.152、0.118、0.176、3.102、0.356 mg 上述成分的贮备液，精密吸取适量，70%甲醇稀释，即得（各成分质量浓度分别为13.9、62.6、117.2、9.9、7.6、5.9、8.8、155.1、17.8 μg／mL）。

2.3 供试品溶液制备精密称取本品内容物1.0 g，精密加入70% 甲醇25 mL，称定质量，超声（250 W、40 kHz）提取60 min，取出，冷却至室温，70%甲醇补足减失的质量，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 阴性样品溶液制备按照胶囊处方工艺分别制备缺白芍、柴胡、丹参的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰基线平稳，峰形对称，分离度均大于1.5，理论塔板数按各成分计均大于4 500，阴性无干扰。

2.5.2 线性关系考察精密吸取“2.2”项下贮备液适量，70%甲醇制成20 倍质量浓度差的6 个线标溶液A～F，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5.3 相对校正因子测定精密吸取“2.5.2”项下线标溶液A～F，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以芍药苷为内标，计算其他8 种成分相对校正因子，结果见表2。

2.5.4 精密度试验取同一供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积 RSD 分别为 0.81%、0.77%、1.65%、0.93%、1.02%、1.17%、1.09%、0.57%、0.70%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5.5 重复性试验取同一批本品内容物，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA含有量RSD 分别为 1.44%、0.56%、1.36%、1.60%、0.75%、1.88%、0.83%、1.26%、1.19%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 稳定性试验取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为0.77%、0.68%、1.61%、0.89%、0.92%、1.19%、1.10%、0.55%、0.71%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.7 加样回收率试验取含有量已知的同一本品适量，倾出内容物，研细，称取9 份，每份约0.5 g，精密吸取对照品溶液（氧化芍药苷0.178 mg／mL、芍药内酯苷0.832 mg／mL、芍药苷1.654 mg／mL、苯甲酰芍药苷0.118 mg／mL、柴胡皂苷a 0.092 mg／mL、柴胡皂苷d 0.068 mg／mL、丹参素0.112 mg／mL、丹酚酸B 2.046 mg／mL、丹参酮ⅡA0.226 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份（分别相当于50%、100%、150%水平），按“2.3”项下方法制备9 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA平均加样回收率分别为 97.46%、98.96%、99.80%、98.09%、97.61%、96.97%、98.48%、100.18%、97.98%，RSD分别为1.03%、0.72%、0.68%、1.29%、1.51%、1.32%、0.95%、0.60%、1.11%。

2.6 相对校正因子影响因素考察

2.6.1 仪器、色谱柱本实验考察了Agilent 1200型、岛津LC-2010 型色谱仪，以及Agilent Extend C18、Agilent Eclipse Plus C18、Hypersil ODS C18、Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 柱温本实验考察柱温25、30、35 ℃对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 体积流量本实验考察体积流量0.8、0.9、1.0 mL／min 对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响。

2.6.4 色谱峰定位本实验以相对保留时间为指标定位色谱峰，并考察“2.6.1”项下仪器、色谱柱对其的影响，结果见表6，可知均无明显影响。

2.7 样品含有量测定取3 批本品，按“2.3”项下方法各平行制备3 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算含有量，结果见表7，可知2 种方法所得结果相近（RSD＜2%）。

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表6 不同仪器、色谱柱对相对保留时间的影响Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表7 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.7 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 待测成分选择解郁胶囊中丹参养血安神、清心除烦，为君药；柴胡、石菖蒲、郁金行气健脾，龙骨、牡蛎镇静安神，为臣药；白芍、首乌藤养血柔肝，炒酸枣仁、五味子宁心安神，黄芪补气固表，地黄养阴生津，麸炒枳壳化痰行气，共为佐药；甘草调和诸药，为使药，诸药合用，共奏养心宁心、疏肝解郁的功效。参考中药质量标志物以君药为主，兼顾臣、佐、使药的原则，本实验选择君药丹参代表性成分丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA，臣药柴胡代表性成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，佐药白芍主要成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷作为研究对象，并以对照品稳定、价格相对较低的芍药苷为内标。

3.2 流动相选择本实验考察了流动相乙腈-水［7，12-14］、甲醇-水，发现后者洗脱时氧化芍药苷、芍药内酯苷、柴胡皂苷d、丹参素分离效果不佳，故选用前者，但此时苯甲酰芍药苷、丹参素、丹参酮ⅡA存在拖尾现象，故将水相改成磷酸［4-6，9-11］，可有效解决上述现象，而且各色谱峰分离效果较好。最终，选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相。