四味土木香散挥发油的β-环糊精包合工艺

李 娜刘德旺赵红梅杭凌宇张 屏包保全

（内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特010110）

四味土木香散为蒙医治疗流感等瘟疫热病的经典方和基础方，经辩证加味可形成62 方，1977 年首次作为民族药载入《中国药典》。该方由土木香、苦参、悬钩子木、山柰4 味药材粉碎成粗粉后混匀制成（微煎），其气香，味极苦、微辛，具有清温解表功效，用于瘟病初期、发热发冷、头痛咳嗽、咽喉肿痛、胸胁作痛等症［1］。方中挥发油是主要活性成分，其中土木香挥发油所含土木香内酯、异土木香内酯具有驱虫、抗菌等作用，而山柰挥发油所含对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯具有抗癌、抑菌、兴奋肠道平滑肌等作用［2-4］。

挥发油为多种类型成分的混合物，包括脂肪族、芳香族、含硫含氮化合物，但更多的为单萜、倍半萜、含氧衍生物，并根据其比重不同分为轻油和重油，它在光、氧条件下极易氧化变质，从而影响复方疗效。β-环糊精是由7 个葡萄糖分子组成的环状结构化合物，其立体结构类似空心圆台，内部以氧原子为主，具有疏水性；外部以羟基为主，具有亲水性，因此能与难溶性药物形成包合物，从而增加药物在水中的溶出度，同时避免药物与光、热、水、氧的直接接触，进而提高其稳定性［5-7］。本实验采用β-环糊精包合混合挥发油，通过正交试验对包合工艺进行优化，并对其进行稳定性考察。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱系统（配置LC-20AD 色谱泵、SPD-20AXR 二极管阵列检测器、Labsolution Version 5.71 SP1 工作站）、IRAffinity-1 红外分光光度计（日本岛津公司）；AB135-S 电子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；MYP11-2磁力搅拌器（上海梅影仪器仪表制造有限公司）；DZ3320A 差热分析仪（南京大展机电技术研究所）；S-4800 扫描电镜（日本日立公司）。

1.2 试剂与药物 土木香内酯（LPT2014005）、异土木香内酯（LPT2014011）、对甲氧基桂皮酸乙酯（110835-201603）对照品均购自中国食品药品检定研究院；肉桂酸乙酯对照品（MAYA-CR5019）购自浙江玛雅试剂有限公司；β-环糊精（天津市大茂化学试剂厂）；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 包合物制备［8-10］采用饱合水溶液法。称取4 g β-环糊精置于250 mL 具塞锥形瓶中，加入100 mL纯化水，置于恒温磁力搅拌器上加热溶解，待溶解完毕、温度升至50 ℃时，缓慢滴加含挥发油的乙醇（1∶10），继续恒温搅拌2 h，取出，置于冰箱中冷藏24 h，快速抽滤，20 mL 水洗涤后再用石油醚洗涤3 次，每次10 mL，40 ℃减压真空干燥器中干燥4 h，即得。

2.2 包合率、收率测定

2.2.1 空白回收率 采用2015 年版《中国药典》挥发油测定法（通则2204）［11］。取300 mL 水，置于装有沸石的圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，移液管加1 mL 二甲苯于挥发油测定器中，加热沸腾蒸馏30 min 后停止加热，放置15 min，读取二甲苯容积。取1 mL 挥发油至圆底烧瓶中，连接测定器加热沸腾蒸馏约5 h，至测定器中油量不再增加时停止加热，放置1 h，读取挥发油体积，自油层中减去二甲苯量，即为挥发油量，平行3 次，计算平均值，公式为空白回收率＝馏出流量／加入挥发油量×100%，测得空白回收率为71%。

2.2.2 包合率 采用2015 年版《中国药典》 挥发油测定法（通则2204）。称取“2.1”项下包合物置于圆底烧瓶中，按“2.2.1”项下方法读取挥发油体积，计算包合率，公式为包合率＝包合物中挥发油体积／加入挥发油体积×100%，测得包合率为74.12%。

2.2.3 收率 取“2.1”项下包合物计算收率，公式为收率＝包合物实际质量／（β-环糊精、挥发油总加入量）×100%，测得收率为83.12%。

2.3 指标性成分含有量、包封率测定［12］

2.3.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1% 磷酸（55∶45）；体积流量1.0 mL／min；检测波长210 nm（土木香内酯、异土木香内酯）、254 nm（对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯）；柱温25 ℃；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 不同波长下各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents under different wavelengths

2.3.2 对照品溶液制备 称取土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯对照品各约2 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL 分别含四者201.1、198.7、203.5、202.2 μg 的溶液，即得。

2.3.3 挥发油供试品溶液制备 称取挥发油约100 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超声处理后定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 包合物供试品溶液制备 称取包合物约500 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超声处理后定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.5 空白样品溶液制备 按照四味土木香处方比例不加挥发油，按“2.1”项下方法制备阴性样品，称取约500 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超声处理后定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.6 线性关系考察 分别取对照品溶液0.2、0.5、1、2、5 mL，加甲醇稀释定容至25 mL，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归。结果，土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯方程分别为Y＝61.32X-8.32（r＝0.999 7）、Y＝58.94X-17.42（r＝0.999 6）、Y＝26.65X＋9.24（r＝0.999 8）、Y＝32.67X＋11.35（r＝0.999 7），均在8.0～200.0 μg／mL范围内线性关系良好。

截至2016年底，我国已并网发电的秸秆直燃发电项目近260个，累计并网装机容量约为6400MW。主要分布在山东省、安徽省、黑龙江省、江苏省、河北省、湖北省、吉林省、河南省、湖南省、山西省。

2.3.7 精密度试验 取“2.3.2”项下对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯峰面积RSD 分别为1.5%、1.8%、1.2%、1.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.8 稳定性试验 取“2.3.2”项下对照品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯峰面积RSD 分别为2.0%、1.6%、1.2%、1.5%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.9 重复性试验 取同一批包合物，按“2.3.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯含有量RSD 分别为1.5%、1.6%、1.2%、1.9%，表明该方法重复性良好。

2.3.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的包合物25 mg，共9 份，土木香内酯、异土木香内酯、对甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯含有量分别为8.87、11.4、13.8、4.3 mg，加入0.8、1.0、1.2 倍量对照品溶液，按“2.3.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率分别为99.30%、98.47%、98.45%、100.7%，RSD分别为2.1%、1.2%、1.7%、1.7%。

2.3.11 包封率测定 公式为包封率＝m包／m总×100%，其中m包为包合β-环糊精挥发油中4 种成分总含有量，m总为未包合挥发油中4 种成分总含有量，测得包封率为78.16%。

2.4 正交试验 通过预实验及文献查阅［13］发现，影响挥发油包合的主要因素为β-环糊精与挥发油比例（A）、包合温度（B）、搅拌时间（C），故选取上述3 个因素，各因素取3 个水平，按L9（34）正交表设计试验，因素水平见表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

以包合率、收率、包封率为评价指标，其中包合率作为主要指标，权重系数设定为0.6；收率、包封率作为次要指标，权重系数均设定为0.2，再将9 批试验中各指标最大者计为1，其余按比例折算后乘以相应权重系数再求和，作为综合评分。结果见表2，方差分析见表3。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表2 可知，各因素影响程度依次为A＞C＞B；由表3 可知，因素A、C对包合效果有显著影响（P＜0.05），而B无显著影响（P＞0.05）。因此，确定最优包合工艺为A2B2C3，即挥发油与β-环糊精比例4∶1，包合温度50 ℃，搅拌时间2 h。

2.6 包合物表征

2.6.1 TLC 精密称取挥发油0.5 g（1 份）、包合物1.0 g（2 份），置于10 mL 量瓶中，乙醇定容至刻度，1 份包合物于乙醇中超声处理45 min，滤过，取续滤液；另1 份包合物溶于乙醇中，不作任何处理。土木香薄层色谱法按照2015 年版《中国药典》 四部通则0502 项下薄层色谱法，将挥发油、包合物点样于同一用0.25%硝酸银溶液制备的硅胶G 薄层板上，以石油醚（69～70 ℃）-甲苯-乙酸乙酯（10∶1∶1）为展开剂，10 ℃以下避光展开2 次，取出，晾干，喷以5% 茴香醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；山柰薄层色谱法按照相同方法，将挥发油、包合物点样于同一GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（18∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（254 nm）下检视，结果见图2。由此可知，供试品色谱在与对照药材相应位置上显相同颜色斑点；解包后包合物斑点及Rf值与挥发油一致，而未解包者无对应斑点，表明挥发油包合前后主要成分基本一致，成功包入β-环糊精空腔中。

表4 验证试验结果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests（n＝3）

图2 样品TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatograms of samples

2.6.2 差式扫描量热（DSC）取挥发油、β-环糊精、挥发油与β-环糊精物理混合物（1∶4）、包合物适量，在氮气环境下进行DSC 扫描，升温速度10 ℃／min，温度范围15～350 ℃，结果见图3。由此可知，挥发油、β-环糊精在108、120 ℃分别有1 个明显吸热峰；物理混合物在上述2 种温度下均有明显吸热峰；包合物DSC 曲线未出现挥发油、β-环糊精吸收峰，仅在80 ℃出现1 个弱峰，而且峰形、峰面积均有变化，表明包合物不是简单的混合物，可能生成了新物相，同时挥发油已包埋于β-环糊精分子空腔内。

图3 样品DSC 曲线Fig.3 DSC curves for samples

2.6.3 傅里叶变换红外光谱（FTIR）取挥发油、β-环糊精、物理混合物、包合物适量，加入适量KBr 混合均匀，压制成片，在4 000～400 cm-1波数范围内进行红外特征测定，结果见图4。由此可知，包合后挥发油在1 716.64、1 604.77、1 514.12、1 265.30 cm-1等处的吸收峰已经消失或明显减弱，而在物理混合物中仍然存在，表明挥发油进入β-环糊精空腔，其红外振动受到限制；包合物特征峰与β-环糊精相似，峰形相同，但前者在1 423.46、1 367.53 cm-1处出现新吸收峰，表明两者是不同物相；物理混合物整体红外吸收特征与β-环糊精相似，但红外吸收中存在大量较弱的吸收峰，表明其红外图谱是由吸收较强的β-环糊精红外图谱与吸收较弱的挥发油红外图谱加和而成的。

图4 样品FTIR 图谱Fig.4 FTIR spectra for samples

2.6.4 扫描电镜（SEM）取β-环糊精、包合物适量，经导电胶粘样、喷金镀膜处理后观察其形态学特征，结果见图5。由此可知，β-环糊精为不规则板状的晶体，并带有细碎颗粒；包合物为表面光滑的块状结晶，无裂纹，与前者相比其形态和晶型发生了重大变化，表明可能形成包合物。

2.7 稳定性考察［12］称取包合物、物理混合物各3 份，每份4 g，密封于玻璃瓶中，分别在强光［（4 500±500）lx］、高湿（90%，25 ℃）、高温（60 ℃）条件下放置10 d，于0、3、7、10 d 取样，测定挥发油相对含有量，结果见表5。由此可知，包合物挥发油含有量在3、7、10 d 呈下降趋势，但程度缓慢，而物理混合物下降非常明显，表明包合物稳定性明显优于物理混合物，并且高温、高湿对挥发油稳定性具有明显影响。

图5 样品SEM 图Fig.5 SEM images for samples

表5 稳定性试验结果（%， n＝3）Tab.5 Result of stability tests（%， n＝3）

3 讨论

四味土木香散中土木香、山柰挥发油是重油、轻油混合挥发油，整体偏重，本实验在提取挥发油时采用2015 年版《中国药典》 挥发油测定法（通则2204）乙法进行测定，再通过饱和水溶液法对其进行包合［14-16］。水蒸气蒸馏法提取挥发油时，从挥发油提取器上只能读出挥发油总体积，而不能测得其主要有效成分含有量，所得工艺与有效成分或疗效的相关性不强；正交试验所优选包合工艺中测得的包合率与最大包封率有所差异，可能是稳定性较差的成分在包合过程中发生结构转化，导致其含有量降低，故本实验以最优包合工艺中的包合率作为主要评价指标，包合率、挥发油包封率为次要指标，对工艺进行综合评价。

四味土木香散是复方制剂，土木香、山柰挥发油共同包合时可减少单独包合工作量，提高制剂稳定性，可为相关新剂型的研发奠定基础。