二氢杨梅素固体分散体的制备及其体内药动学研究

范炎峰荆 玲范金点邹梦梦刘宽浩

（1.黄河科技学院，河南 郑州450063； 2.广东药科大学，广东 广州510006； 3.郑州市第六人民医院，河南 郑州450015）

二氢杨梅素主要存在于蛇葡萄科葡萄属植物中，是一种二氢黄酮醇类化合物，具有明显的抗炎、抗过敏作用，其机制可能与抑制组胺和白三烯释放有关［1］，并且清除氧自由基也是其发挥抗炎活性的机制之一［2］，除此之外，它还具有抗肿瘤、降血脂、降血压、抗糖尿病、预防心脑血管疾病等多种药理作用［3-6］。但二氢杨梅素溶解度很差，导致其体内吸收受到极大限制［7］，严重影响药效发挥，目前相关制剂学研究有脂质体、自微乳、微囊等［8-10］。

固体分散体是将难溶性药物在一定条件下高度分散到水溶性高分子材料（如PVP、PEG 等）中形成的一种给药制剂，可显著增加溶解度、溶出速率、溶出度［11-12］，其制备工艺简单，辅料安全性高，应用非常广泛。因此，本实验将二氢杨梅素制成固体分散体，对亲水性高分子材料及其用量进行筛选，采用XRD 技术研究晶型变化，测定溶解度、溶出度，考察体内药动学，以期为相关口服制剂研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（配置DAD 检测器、自动进样器等，美国Agilent 公司）；ME155DU 型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；ZNCLBS 型智能数显加热磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；D8 ADVANCE 型X 射线粉末衍射仪（瑞士Bruker 公司）；MD400-2 型氮气吹扫仪（浙江杭州奥威仪器有限责任公司）；THZ-82 型往返恒温振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）；MixPlus 型漩涡混合仪（合肥艾本森科学仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 二氢杨梅素对照品（批号Y25A6K1，纯度98.6%，上海源叶生物科技有限公司）；二氢杨梅素原料药（批号20171125P，纯度＞98%，湖北远成赛创科技有限公司孝南分公司）；芹菜素对照品（批号P0587，纯度99.4%，成都瑞芬思生物科技有限公司）。PEG 4000（批号P161010，海安国力化工有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮 K30（PVP K30，批号25000240379，亚什兰集团公司）；泊洛沙姆188（F68，批号20160512，湖北鸿运隆生物科技有限公司）。SD 大鼠，雌雄兼具，体质量约300 g，购自河南省实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（豫）2016-0002。

2 方法与结果

2.1 二氢杨梅素含有量测定

2.1.1 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1% 磷酸（45∶55）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长290 nm；进样量20 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取干燥的二氢杨梅素对照品20 mg，转移至50 mL 量瓶中，乙腈超声溶解，放置0.5 h 后流动相定容，得0.4 mg／mL 贮备液，流动相逐步稀释，得到40、20、10、1.0、0.05 μg／mL 对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝31.339X＋2.954 6（r＝0.999 9），在0.05～40 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.3 方法学考察 取高、中、低质量浓度（40、20、0.05 μg／mL）对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得峰面积RSD 均小于0.41%，表明仪器精密度良好。取10 mg 固体分散体于50 mL 量瓶中，20 mL 乙腈超声处理后流动相定容至50 mL，于0、1、2、3、4、5 d 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得峰面积RSD 为1.05%，表明溶液在5 d 内稳定性良好。取固体分散体适量，平行制备6 份溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得峰面积RSD 为1.33%，表明该方法重复性良好。精密称取含有量已知的固体分散体适量，加入不同质量浓度对照品溶液，置于50 mL 量瓶中，乙腈超声处理后流动相定容，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率为99.11%，RSD 小于1.48%。

2.2 体外溶出度试验 取待测样品适量（以二氢杨梅素计30 mg），加入3 mL 蒸馏水，置于活化后的透析袋中［13］（截留分子量8 000～10 000 Da），溶出仪转速100 r／min，温度37 ℃，释放介质为900 mL经脱气处理的蒸馏水。于预定时间取样3 mL，同时加入3 mL 空白溶出介质，溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量。

2.3 固体分散体制备 称取二氢杨梅素20 mg、载体材料（PVP K30、PEG 6000、F68）适量于圆底烧瓶中，加入50 mL 无水乙醇，45 ℃水浴下磁力搅拌均匀，放置4 h 至澄清，减压旋蒸除去有机溶剂，残留物置于45 ℃真空干燥箱中干燥24 h，即得，粉碎后过24 目筛备用。

2.4 处方筛选

2.4.1 载体材料 固定二氢杨梅素与载体质量比1∶8，考察PVP K30、PEG 6000、F68 对二氢杨梅素溶出速率、溶出度的影响，结果见图1。由此可知，PVP K30 作为载体材料时溶出速率及240 min内累积溶出度均高于F68、PEG 6000，故选择其作为载体材料。

图1 不同载体下固体分散体溶出曲线Fig.1 Dissolution curves for solid dispersions loaded by different carriers

2.4.2 药载比 考察药载比1∶5、1∶6、1∶8、1∶10 时对二氢杨梅素溶出速率、溶出度的影响，结果见图2。由此可知，药载比为1∶8 时溶出速率、溶出度均接近1∶10，故选择其作为药载比。

图2 不同药载比下固体分散体溶出曲线Fig.2 Dissolution curves for solid dispersions with different drug-carrier ratios

2.5 晶型分析 将二氢杨梅素与PVP K30 按1∶8比例简单混合，作为物理混合物。扫描条件为铜靶，扫描速度5°／min，扫描范围3°～45°，管压40 kV，管流200 mA，结果见图3。由此可知，二氢杨梅素制备成固体分散体后由结晶型态转变为典型的无定型态；物理混合物XRD 图谱中仍可观察到二氢杨梅素结晶峰，表明简单的混合并不能改变该成分存在状态。

2.6 表观溶解度测定 取过量二氢杨梅素、物理混合物、固体分散体分别加到蒸馏水中，25 ℃下恒温摇床法振荡平衡48 h，0.45 μm 微孔滤膜过滤，测定表观溶解度，结果见表1。由此可知，制成固体分散体后二氢杨梅素表观溶解度提高了9.8倍，而物理混合物仅小幅提高。

图3 样品XRD 图谱Fig.3 XRD patterns for samples

表1 样品表观溶解度测定结果（n＝3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of samples（n＝3）

2.7 体外溶出度测定 按“2.2”项下方法测定二氢杨梅素、固体分散体体外溶出度，结果见图4。由此可知，固体分散体120 min 累积溶出度即接近100%，而二氢杨梅素240 min 时仅为36.49%。

图4 样品溶出曲线Fig.4 Dissolution curves for samples

2.8 体内药动学研究

2.8.1 灌胃液制备 分别取二氢杨梅素、物理混合物、固体分散体适量，0.5% CMC-Na 溶液配制成18.0 mg／mL 混悬液（以二氢杨梅素计），即得。

2.8.2 分组、给药、采血［14］取SD 大鼠18 只，随机分为3 组、按150 mg／kg 剂量（以二氢杨梅素计）分别给予“2.8.1”项下3 种灌胃液，于0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h玻璃毛细管眼眶取血各约0.3 mL，置于肝素浸润的离心管中，混匀后迅速离心（4 000 r／min）2 min，转移上层血浆至另一空白离心管中，冷冻保存。

2.8.3 血浆样品处理 配制200 mL 提取溶液正己烷-二氯甲烷-异丙醇（100∶60∶10），备用。吸取血浆样品100 μL、内标溶液50 μL，置于离心管中，涡旋1 min，加入4 mL 提取溶剂再涡旋5 min，高速离心（10 000 r／min）15 min，分取上层有机相，氮气吹干，残渣用100 μL 流动相复溶。

2.8.4 方法学考察 精密称取10.0 mg 芹菜素对照品至10 mL 量瓶中，乙腈超声溶解，流动相定容，再用流动相稀释至1.0 μg／mL，作为内标溶液。取“2.1.2”项下不同质量浓度对照品溶液，大鼠空白血浆分别制成0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg／mL含药血浆，精密量取100 μL，加入50 μL内标溶液，按“2.8.3”项下方法处理。以溶液质量浓度为横坐标（X），二氢杨梅素与内标峰面积之比为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.040 9X-4.025 4（r＝0.990 9），在0.1～5.0 μg／mL范围内线性关系良好。取空白血浆、灌胃给药12 h 血浆样品加内标、血浆对照品溶液（0.1 μg／mL）适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图5，可知血浆内源性物质不干扰内标、二氢杨梅素色谱峰，该方法专属性良好。

2.8.5 方法学考察 取低（0.1 μg／mL）、中（2.5 μg／mL）、高（5.0 μg／mL）质量浓度含药血浆，测得日内、日间精密度RSD 分别小于7.11%、9.94%，表明该方法精密度良好。将测定质量浓度与实际配制质量浓度比较，计算回收率，测得在87.58%～92.44%之间。血浆样品保存于-20 ℃冰箱中，于0、1、2、3、4、5 d 测定二氢杨梅素与内标峰面积的比值，测得RSD 为7.90%；置于室温下，于0、1、2、6、8、12 h 测定，测得RSD 为6.72%，表明样品在放置、测定过程中稳定性良好。取含药血浆进行逐步稀释，以信噪比S／N＝10为定量限，S／N＝3 为检测限，测得两者分别为0.02、0.005 μg／mL。综上所述，上述方法可用于二氢杨梅素血药浓度测定。

图5 二氢杨梅素HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of dihydromyricetin

2.8.6 分析结果 主要药动学参数采用3P97 程序统计矩模型计算，AUC、Cmax经对数转换后采用独立样本t检验，t1／2、tmax采用非参数法秩和检验，结果见图6、表2。由此可知，与原料药、物理混合物比较，固体分散体tmax缩短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），相对生物利用度提高了2.66 倍。

图6 样品血药浓度-时间曲线Fig.6 Plasma concentration-time curves for samples

表2 样品主要药动学参数（±s， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

表2 样品主要药动学参数（±s， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for samples（， n＝6）

注：与二氢杨梅素或物理混合物比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。

3 讨论

二氢杨梅素溶解度仅为212.9 μg／mL，在240 min内累积溶出度仅为36.49%，而将该成分制成固体分散体后，溶解度可提高至9.8 倍，体外溶出速率、累积溶出度均得到明显改善，为促进药物吸收、提高生物利用度奠定了基础。研究表明，固体分散体提高溶解度、溶出速率可能与减小颗粒粒径（以分子或微晶状态存在于固体分散体中）、增强润湿性（亲水性高分子材料）、提高药物疏松程度、改变药物晶型（转变为无定型状态）等作用有关［14-16］。

二氢杨梅素脂质体、自微乳、微囊等［8-10］制剂技术制备工艺复杂，其中制备自微乳需使用大量表面活性剂，而二氢杨梅素脂质体或微囊包封率均不高，分别仅为54.7%［8］、66.13%［10］，可能与该成分本身理化性质有关［17-18］。蒋才武等［19］曾以PEG 6000 为载体，对二氢杨梅素固体分散体进行了研究，而本研究发现采用PVP K30 材料时，固体分散体溶出速率和药物累积溶出度均高于PEG 6000，并且当药物、载体材料用量比例1∶8 时，120 min内二氢杨梅素基本溶出完毕；与原料药相比，固体分散体tmax明显提前，可能与该技术可加快药物溶出、提高溶出速率等有关［12］，同时Cmax、相对生物利用度明显提高，可能是由于该技术可提高药物溶解度、溶出度，促进药物吸收。

药物在体内顺利被吸收除了与其本身溶解度有关外，还与其透膜能力（脂溶性）相关，文献［15，20］报道，固体分散体技术虽然能极大改善难溶性药物水溶性、溶出度，但对其脂溶性影响很小。此外，药物吸收还可能受到胃肠道环境等因素影响［13］，从而使生物利用度提高程度受到一定限制。本实验成功制备了二氢杨梅素固体分散体，其工艺简单，材料安全，促进药物吸收结果明显，今后将对其药效学进行评价［21］，以期为相关制剂研发提供更全面可靠的依据。