转录因子FoxO3a对PC12细胞朊蛋白管家基因表达调控的影响

蒋国红 张骏 王长明 张丽

(遵义医科大学附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)

叉头转录因子O亚型(FoxO)3a是胰岛素样生长因子(IGF)-1-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路下游重要的转录因子，其上游受PI3K-AKT磷酸化级联通路的调节，下游调节靶基因，在DNA损伤修复、细胞能量代谢、细胞周期停滞、细胞凋亡、细胞自噬、衰老等方面起到重要作用〔1，2〕。研究发现，转录因子p53、Yin-Yang(YY)1等均能够调控朊蛋白管家基因(PRNP)表达，但FoxO3a是否能调控PC12细胞中PRNP基因表达尚无相关报道〔3，4〕。为此，本研究拟探讨FoxO3a对PC12细胞PRNP表达调控的影响。

1 材料和方法

1.1实验细胞及主要试剂 PC12及293T细胞购自中山大学实验中心细胞库；胎牛血清购自Hyclone公司；Trizol购于Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；朊蛋白(PrP)、β-actin一抗抗体购自Santa Cruz公司；小量质粒抽提试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自Promega公司；FoxO3a siRNA转染套装购自广州锐博生物科技有限公司；pcDNA3.1-FoxO3a质粒由本实验室构建并保存；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司。

1.2细胞培养 将PC12细胞培养于10%灭活胎牛血清，双抗青霉素终浓度为100 μg/ml、链霉素为100 μg/ml的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，每24 h更换培养液，约2 d传代一次，取生长状态良好、细胞长满培养瓶壁80%后的细胞用胰酶消化后传代。

1.3siRNAs 基因沉默实验 根据FoxO3a亚基的mRNA序列，设计3条siRNA序列及阴性对照探针(见表1)，由上海吉玛生物制药技术有限公司设计并合成，其中阴性对照探针序列与目的靶细胞中其他基因没有同源性。当细胞密度达到50%～60%时，采用脂质体Lipofectamine2000进行瞬时转染，24 h后实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测FoxO3a基因表达情况，筛选出抑制效率最好的siRNA序列。实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA(S1、S2、S3)组，再进行转染，24 h后RT-PCR检测PRNP表达情况。

表1 FoxO3a的siRNA模板序列

1.4RT-PCR 按TRizol试剂盒说明书提取细胞的总RNA，用DNase Ⅰ对RNA进行处理。GenBank上查找目的基因mRNA序列，在蛋白编码区(CDS)设计特异性引物：FoxO3a上游引物：5′-CGGCTCACTTTGTCCCAGAT-3′，下游引物：5′-GGCGGATGGAGTTCTTCCA-3′；PRNP上游引物：5′-GGAGAACTTCACGGAGACCG-3′,下游引物：5′-CTCCCGTCGTAATAGGCCTG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′，下游引物：5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。逆转录为cDNA，采用SYBR绿荧光染料法。

1.5Western印迹 利用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液从细胞提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量法测定蛋白浓度，蛋白上样量为40 μg，12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后将其转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育AKT/磷酸化(p)AKT、FoxO3a/pFoxO3a、GAPDH一抗，4℃过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠/山羊抗兔二抗室温孵育2 h，洗膜、化学发光、显影、扫描，凝胶分析系统分析蛋白表达的灰度值变化。蛋白表达量以各组灰度值占对照组灰度值的比值来表示。

1.6双荧光素酶报告基因检测试验

1.6.1载体构建 针对PRNP-3′非翻译区(UTR)设计并合成扩增引物序列(上游：5′-GATCGAGCATGGTCCTCTTC-3′，下游：5′-GGTGCTCATCTTCGCTC-GTTTA-3′)，采用20 μl体系，循环参数为94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，30个循环；72℃ 3 min。将PCR扩增得到的PRNP启动子片段连接于pMD18-T载体，连接产物转化DH5α细菌，测序证实后，纯化回收，酶切，克隆入pGL3-Basic载体，构建pG3L-PRNP报告基因载体。同样方式构建pcDNA3.1-FoxO3a表达载体，引物序列：上游5′-CCCAAGCTTACCATGGCAGAGGCACCGGCTT-3′，下游5′-CATGTCTAGATCAGCCTGGCACCCAGCTC-3′。构建的载体将通过测序检测是否正确。

1.6.2报告基因转染及荧光素酶(Luc)活性的测定 将质粒转染293T细胞〔海肾荧光素酶pRL系列(pRL-TK)质粒作为内参〕，3个复孔检测，采用双荧光报告基因法检测Luc活性，进而评估启动子的活性，转染的组别如下：基础对照组(pGL3-Basic+pRL-TK)、阳性对照组(pGL3-Control+pRL-TK)、实验组Ⅰ(pGL3-PNRP+pRL-TK)、实验组Ⅱ(pGL3-PNRP+pcDNA3.1-FoxO3a+pRL-TK)、pcDNA3.1(+)空载体对照组〔pGL3-PNRP+pcDNA3.1(+)+pRL-TK〕、FoxO3a质粒对照组(pGL3-Basic+pcDNA3.1-FoxO3a+pRL-TK)，共6组。转染24 h后，吸去细胞培养上清，PBS洗涤1次；每孔加入200 μl裂解液，摇床缓慢裂解15 min，12 000 r/min离心10 min，上清转至新的离心管；取20 μl上清液加入100 μl Luc检测试剂Ⅱ测量萤火虫荧光素酶(FLuc)活性，再加入100 μl Stop & GloTM测定海肾荧光素酶(RLuc)活性,FLuc/RLuc即相对Luc活力值。所有试验重复3次，取平均值。

1.7统计学分析 采用SPSS23.0软件进行独立样本t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1FoxO3a基因 siRNAs转染效率 FoxO3a基因抑制后其siRNAs相对表达水平分别为0.36±0.16(S1组)、0.74±0.21(S2组)、0.57±0.18(S3组)。与空白对照组(1.00±0.13)相比，S1探针的抑制率最高，后续试验选用S1探针。

2.2FoxO3a基因沉默对PRNP基因表达的影响 与阴性对照组相比，S1组PRNP基因显著升高(1.81±0.32 vs 1.00±0.16，P<0.05)。阴性对照组与空白对照组(0.96±0.21)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3FoxO3a基因沉默对朊蛋白(PrP)表达的影响 如图1所示，与空白对照组相比，阴性对照组的PrP表达情况未发生明显改变，而S1组FoxO3a基因被沉默后，PrP表达显著升高，与基因水平一致。

1～3：空白对照组、阴性对照组、S1组图1 各组FoxO3a基因沉默后PrP表达

2.4载体构建及双荧光素酶报告基因检测结果 pGL3-PNRP及pcDNA3.1-FoxO3a载体经酶切及测序鉴定，结果完全正确，构建成功。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与基础对照组相比，阳性对照组FLuc/Rluc值明显提高(2.459±0.244 vs 0.204±0.112)，实验组Ⅰ的FLuc/Rluc值(1.453±0.315)也显著高于基础对照组(P<0.01)；与实验组Ⅰ相比，实验组Ⅱ的FLuc/RLuc值(0.447±0.103)明显下降(P<0.01)；pcDNA3.1(+)空载体对照组FLuc/RLuc值(1.484±0.253)显著高于基础对照组(P<0.01),FoxO3a质粒对照组FLuc/RLuc值(0.213±0.088)与基础对照组无明显差异(P>0.05)。

3 讨 论

FoxO蛋白是IGF/胰岛素信号通路下游一个重要的转录因子，人类有4个FoxO同源基因，分别为FoxO1、FoxO2、FoxO3a和FoxO4〔5〕。RT-PCR 及Northern印迹显示FoxO转录因子( FoxO1、FoxO3a) 广泛表达于成人的各组织器官中，包括心、脑等〔4，6〕。近年来，人们对FoxO3a的作用机制研究逐渐从肿瘤细胞转移到了神经细胞，发现其既可在PI3K/AKT通路激活时磷酸化或沉默信息调节因子1调控下去乙酰化，促进神经细胞存活、增殖；也可在PI3K/AKT通路受抑制时去磷酸化或P300蛋白调节下乙酰化，诱导神经细胞凋亡〔7，8〕。本课题前期研究结果发现，PI3K/AKT/FoxO信号通路参与了PNRP的表达调控，AKT及FoxO3a蛋白磷酸化的变化可能起到重要作用〔9，10〕。FoxO3a的磷酸化/非磷酸化状态与转录调节功能有密切关系。本研究提示，FoxO3a与PRNP的表达存在关联且呈负调控关系。研究发现，不同种类的FoxO转录因子通过识别共有的DNA结合序列5′-TTGTTTAC-3′结合到靶基因的启动子区域，进而调控靶基因的表达〔11～13〕。本研究显示，FoxO3a可能通过结合PRNP启动子区域而抑制其转录。本研究同时设置其他几个组别，用来研究其他因素是否会影响实验组Ⅰ、Ⅱ的结果，发现并无明显影响，说明实验结果可靠。综上，FoxO3a可以负调控PRNP表达，这种调控是通过结合PRNP启动子区域而抑制其转录来实现的。但FoxO3a蛋白与PRNP启动子结合是直接结合还是涉及其他中间物质有待研究。