黑龙江省东部地区汉族人群PCSK9基因第8、9外显子多态性与冠心病的相关性

赵晓辉 黄咏 王秀艳 王立波

(佳木斯大学附属第一医院心内一科，黑龙江 佳木斯 154002)

根据WHO公布的资料显示，每年约有380万例男性及340万例女性死于冠心病(CHD)，占全部死亡的12.2%，CHD已成为全世界人群引起死亡的首要原因。临床证实，CHD发生及发展与年龄、性别、高血压、高血糖、高血脂、高盐饮食及吸烟关系密不可分，在以上多重危险因素的参与下形成复杂的致病机制，其中血脂沉积是其最明确也是最重要的独立危险因素。

前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK)9是一种丝氨酸蛋白酶，通过低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)调节肝脏载脂蛋白(Apo)B摄取和胆固醇代谢〔1,2〕。在临床中，升高的ApoB 与动脉粥样硬化的发生和进展有关〔3,4〕。 Canvex等〔5〕表明 PCSK9 可以与 ApoB 的 N-末端区域内的氨基酸序列结合，并且在小鼠原代肝细胞中 PCSK9 的过表达诱导了 ApoB100 的生物合成。这反过来可能增加血浆LDL水平并导致高胆固醇血症和动脉粥样硬化。PCSK9功能获得性突变体可结合肝细胞表面LDLR，通过网格蛋白介导的内吞作用进入肝细胞，在酸性pH下加强二者的结合能力，增加LDLR在溶酶体的降解，阻止LDLR循环至细胞表面，使LDL-胆固醇(C)清除率下降，增加血清LDL-C水平，最终导致动脉粥样硬化的形成〔6，7〕。极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒残留物是ApoB脂蛋白残留物，被认为是致动脉粥样硬化脂蛋白〔8,9〕。PCSK9作为ApoB脂蛋白的新靶点，可以调节ApoB脂蛋白降解和胆固醇代谢〔10～12〕。因此推荐在持续大剂量用他汀类药物后，仍存在高 LDL-C 的患者中使用 PCSK9 抑制剂〔13,14〕。本文拟分析PSK9基因第8、9外显子多态性与CHD相关性。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取佳木斯大学附属第一医院2017年3月至2018年11月因胸闷、胸痛、呼吸困难及存在疑似冠脉狭窄的表现而入院接受冠脉血管造影(CAG)确诊CHD者为CHD组共303例，非CHD者为对照组共233例。在接受试验前均详细告知具体流程、注意事项及风险性，研究对象知晓并同意。CHD组纳入标准：经CAG确诊至少一支主要的冠脉狭窄程度≥50%。排除标准：非黑龙江省东部地区人(在黑龙江省东部主要城市居住不足10年)、非汉族人群、肝肾疾患、甲状腺疾病、心肌梗死、脑卒中或短暂性脑出血发作、癌症或当前有肾脏、甲状腺、肝脏系统疾病的外周血管疾病、炎症性疾病、慢性心力衰竭。

1.2流行病学调查 收集并整理性别、年龄、血压、血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、LDL-C、饮酒、吸烟等一般资料与临床资料。

1.3血标本采集 均于空腹8 h后用普通生化管抽取外周静脉血2 ml，并借助全自动生化分析仪进行血脂水平等的检测；另外用含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取外周静脉血3 ml用于DNA的粗提取。

1.4DNA提取 采用北京(索来宝)生物科技有限公司全血基因组DNA提取试剂盒。

1.5测序及分析 将所得产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行基因测序，测序结果应用SnapGene及Chromes 等相关软件查看峰图文件，通过双向测序结果识别PCSK9基因第8、9外显子单核苷酸多态性(SNPs)，同时与基因库中相关序列进行对比分析。

1.6统计学分析 采用SPSS24.0软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1基线资料 CHD组高血压、糖尿病、吸烟人数均显著多于对照组(P<0.01)；CHD组年龄明显高于对照组(P<0.05)。CHD组血浆TG、TC和LDL-C水平均显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般临床资料及临床资料比较

2.2PCR扩增产物测序结果 基因遗传规律符合Hardy-Weinberg平衡定律。经过序列比对，在第8外显子未发现基因突变位点。在第9外显子有3处突变位点：c.477 T>C 、c.604 C>T、c.606 C>T，突变频率分别是0.37%、1.67%、0.93%，均为错义突变。其中，对照组c.477 T>C突变位点，CHD组c.604 C>T、c.606 C>T氨基酸改变为T〔Thr〕⟹M〔Met〕,C〔Cys〕⟹K〔Arg〕。

2.3PCSK9基因第9外显子突变位点与血脂相关性 对照组中c.477 T>C突变2例血清LDL-C浓度水平〔(2.98±0.08)mmol/L〕与未突变231例〔(2.47±0.58)mmol/L〕无明显差异(t=1.25,P=0.214)。CHD组中基因位点c.604 C>T突变9例与非突变289例LDL-C浓度水平〔(3.06±0.69)vs(2.65±0.82)mmol/L〕有明显差异(t=-1.499,P=0.036)。CHD组中基因位点c.606 C>T突变5例与非突变289例血清LDL-C浓度水平〔(2.57±0.53)vs(2.65±0.82)mmol/L〕无明显差异(t=0.227,P=0.810)。

3 讨 论

本实验发现，高血压、糖尿病、吸烟、TC、LDL-C是CHD的危险因素，与国内外〔6～13〕报道一致。

PCSK9被发现与家族性高胆固醇血症相关〔15〕，PCSK9可通过多种途径调节循环血清LDL-C水平，同时PCSK9引起的炎症反应和细胞生物学功能等过程的参与也对CHD产生直接作用，并且PCSK9基因突变则可通过改变其编码蛋白的功能介导CHD发病。通过对比NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_009061.1)，证实PCSK9基因共含有12个外显子，其中第8、9外显子翻译的蛋白质具有重要作用。基因c.477 T>C突变属于功能缺失型突变，其编码蛋白不引起血清LDL-C水平的改变；其次，样本量偏少，不明确突变后编码蛋白的作用机制，不足以提供确切信息，需进一步探讨。突变位点c.606 C>T改变编码蛋白，故该突变位点属于功能缺失型突变。突变位点c.604 C>T突变体与血清LDL-C浓度有关，对比NCBI，该突变位点改变编码蛋白。

综上所述，PCSK9第9外显子基因突变可能与CHD发生及发展有关。