氨基酮戊酸-光动力疗法对尖锐湿疣组织中血管内皮生长因子和增殖细胞核抗原表达的影响

尹光文 刘聪 王小云 张华 王梦奇

郑州大学第一附属医院皮肤科 450052

尖锐湿疣由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见性传播疾病，其传染性强，少数甚至有癌变可能。临床上缺乏有效的抗HPV感染的药物，传统治疗方法如激光、冷冻等虽可清除疣体，但不能清除HPV亚临床感染及潜伏感染，导致治疗后复发率高，常给患者带来较大痛苦，严重影响患者生活质量［1］。氨基酮戊酸光动力疗法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）治疗尖锐湿疣具有疗效好、复发率低、不良反应少、可重复治疗和适用于特殊人群等优点［2-3］。我们通过检测ALA-PDT治疗前后尖锐湿疣患者疣体组织中血管内皮生长因子（VEGF）和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达变化，探讨ALA-PDT对尖锐湿疣组织血管生成和增生的影响。

一、对象与方法

1.对象：2016年10月至2017年9月就诊于郑州大学第一附属医院皮肤科门诊的56例尖锐湿疣患者。其中，男30例，女26例，年龄19～65（34.55±12.25）岁；病程2周至3个月［（50.32±19.60）d］。男性患者疣体多位于阴茎、包皮、系带、肛周等部位，女性皮损主要分布在会阴、阴道口等部位。患者均具典型临床表现，醋酸白试验均阳性，临床表现不典型的经组织病理证实符合尖锐湿疣的病理改变。患者均系初次就诊，无其他系统性疾病。本研究通过郑州大学基层伦理审查委员会审查批准（科研快审2016-71），受试者均签署知情同意书。

2.试剂：兔抗人VEGF多克隆抗体和兔抗人PCNA多克隆抗体产自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，3，3-二氨基联苯胺显色试剂盒及过氧化物酶标记的链霉亲和素（SP）试剂盒产自北京中杉金桥生物技术有限公司。

3.治疗方法：将氨基酮戊酸散（复旦张江生物医药股份有限公司）充分溶解于0.5 ml灭菌注射用水，配制成浓度为20%的溶液，严格按照ALA-PDT的治疗方法操作，每周治疗1次。治疗前以手术刀片取56例尖锐湿疣疣体组织设为对照组。第1次治疗后1周，同法取与治疗前相同位置的疣体组织作为实验组。所有标本切除后立即固定24 h，石蜡包埋，制作4 μm厚切片。

4.免疫组化SP法检测VEGF及PCNA的表达：按试剂盒说明采用免疫组化SP法检测组织切片角质形成细胞中VEGF及PCNA的表达，以已知染色阳性切片作为阳性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照。VEGF阳性表达定位在细胞质，PCNA阳性表达定位于细胞核，阳性表现均为淡黄色至棕褐色颗粒样物质。评定标准参照相关文献［4］，对VEGF和PCNA表达综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量处理：未着色为0分，浅黄色1分，黄色2分，棕黄或棕褐色3分；阳性细胞占总细胞数百分比≤10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别对应评分0、1、2、3、4分。2项评分的乘积为总分，总分9～12分为强阳性（+++），6～8分为阳性（++），1～4分为弱阳性（+），0分为阴性（-）。

5.统计学处理：采用SPSS17.0软件分析实验数据，分别采用χ2检验和秩和检验分析治疗前后VEGF及PCNA蛋白表达率和表达强度的差异，采用Spearman分析检验VEGF及PCNA蛋白表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.ALA-PDT治疗前后尖锐湿疣组织中VEGF的表达：见图1。VEGF表达定位在细胞质，阳性细胞遍布表皮全层，基底层、棘层显著表达，颗粒层表达渐减弱。ALA-PDT治疗前，56例尖锐湿疣患者中40例（71.43%）表达VEGF，表达强度多为++～+++；治疗后25例（44.64%）表达VEGF，表达强度多为-～+。治疗前后VEGF表达率差异有统计学意义（χ2=8.25，P＜0.05），表达强度差异亦有统计学意义（H=11.29，P ＜ 0.05），见表1。

2.ALA-PDT治疗前后尖锐湿疣组织中PCNA的表达：见图1。PCNA表达于细胞核，分布在表皮的基底层、棘层甚至颗粒层，呈淡黄色至棕褐色。ALA-PDT治疗前，56例尖锐湿疣患者中41例（73.21%）表达PCNA，表达强度为++～+++；治疗后23例（41.07%）表达PCNA，表达强度为-～+。治疗前后PCNA表达率差异有统计学意义（χ2=11.81，P＜0.05），表达强度差异亦有统计学意义（H=12.22，P＜0.05），见表1。

图1 氨基酮戊酸-光动力疗法治疗前后血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）在尖锐湿疣（CA）组织中的表达（SP法） 治疗前，CA组织细胞VEGF表达强度较高，PCNA呈高强度表达；治疗后，CA组织细胞VEGF和PCNA表达强度均下降

表1 ALA-PDT治疗前后尖锐湿疣组织中VEGF和PCNA的表达强度 例

3.ALA-PDT治疗前后尖锐湿疣组织中VEGF与PCNA表达的相关性：治疗前后尖锐湿疣组织中VEGF与PCNA表达均呈正相关（rs值分别为0.202、0.273，均P ＜ 0.05）。

三、讨论

VEGF是血管形成最强有力的调控因子，其表达降低能够减少新生血管的生成。有文献报道，VEGF在尖锐湿疣组织中呈高表达状态，其表达强度和微血管密度存在明显联系［5］。ALA-PDT治疗胶质瘤24 h后，VEGF表达逐渐下降，最终抑制血管生成，进而达到抗肿瘤目的［6］。本研究结果显示，尖锐湿疣组织中VEGF在ALA-PDT治疗前高表达，而ALA-PDT治疗后表达明显减少，治疗前后差异有统计学意义，推测ALA-PDT可通过降低VEGF表达而抑制血管的生成，这可能是ALA-PDT治疗CA的作用机制之一，但具体机制有待进一步研究。

PCNA也是反映细胞增殖活性的指标，参与多种生理过程，是细胞增殖状态的理想标志物［7］。既往研究发现，尖锐湿疣组织高表达PCNA［8］，表明尖锐湿疣组织角质形成细胞增殖活跃。Xie等［9］观察发现ALA-PDT治疗后24 h，人鼻咽癌裸鼠肿瘤细胞中PCNA表达明显降低。我们观察发现，PDT治疗后尖锐湿疣组织角质形成细胞中PCNA表达率和表达强度均明显降低，与Xie等［9］研究结果一致。提示ALAPDT能够抑制尖锐湿疣组织角质形成细胞的增殖，但其确切机制尚不清楚，推测抑制血管生成可能是ALA-PDT抑制CA组织角质形成细胞增殖的作用机制之一。

有研究表明，尖锐湿疣组织中存在VEGF和PCNA的过度表达，二者表达存在正相关性［10］。本研究结果显示，ALAPDT治疗后尖锐湿疣组织中VEGF与PCNA表达呈正相关，推测ALA-PDT通过抑制VEGF表达来抑制血管生成，进而抑制角质形成细胞增殖，促进尖锐湿疣消退。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突