蕈样肉芽肿皮损中TOX蛋白的表达及其诊断价值评估

张筱雁 王琳

四川大学华西医院皮肤性病科，成都 610041

张筱雁现在川北医学院附属医院皮肤科，四川南充 637000

蕈样肉芽肿（MF）是最常见的皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL），约占所有皮肤淋巴瘤的50%［1］。随着病情进展，MF分为斑片期、斑块期和肿瘤期。斑块期和肿瘤期患者临床及组织病理学改变具有特征性，诊断较为容易。而早期MF（斑片期）临床表现差异较大，易与其他良性炎症性皮肤病相混淆，组织病理学改变缺乏特异性，炎症细胞较多，而肿瘤细胞少，致T细胞受体基因重排容易出现假阴性，缺乏阳性标志物，需要更多可靠的指标进行早期预测。胸腺细胞选择相关高迁移率族基因（thymocyte selection-associated high mobility group box gene，TOX基因）编码TOX蛋白，TOX蛋白属于高迁移率家族（high mobility group box，HMG-box）蛋白超家族的一员，主要通过修饰染色体结构起转录因子的作用。2012年Zhang等［2］首次发现TOX在早期MF皮肤组织中的CD4+CD8-肿瘤T细胞中表达升高，在良性炎症性皮肤病以及正常皮肤中不表达，从而提出TOX可能是诊断早期MF的分子标志物。我们拟采用免疫组化法（SP法）检测TOX在疑似MF、确诊MF及良性炎症性皮肤病中的表达情况，并结合前期实验结果，探讨TOX在MF中的诊断价值，寻找筛查及诊断早期MF的新方法。

材料与方法

1.材料：63份标本均为四川大学华西医院皮肤科病理室2003—2016年制备的石蜡包埋组织标本。其中，30份为疑似MF病例标本，23份为确诊MF病例标本，10份良性炎症性皮肤病病例标本。MF组织学诊断标准参照2008年WHO淋巴造血组织肿瘤分类中对MF的组织学描述［3］。疑似MF病例是根据国际皮肤淋巴瘤学会和欧洲癌症研究治疗特别工作组（International Society for Cutaneous Lymphomas/European Organization for Research and Treatment of Cancer，ISCL/EORTC）提出的测算法则［4］，结合临床表现及组织病理学改变高度怀疑为MF，但进一步进行免疫组化染色及T细胞受体基因重排（TCR-GR），未达到MF的诊断标准，即评分之和低于4分。

2.免疫组化检测63份标本中TOX蛋白表达

按鼠/兔共用二步法检测试剂盒（美国Zymed公司）说明进行免疫组化染色。一抗为兔抗人TOX多克隆抗体（美国Sigma公司），工作浓度1∶400，二抗为标记有辣根过氧化物酶的抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚物分子（美国Zymed公司）。将石蜡切片经过脱蜡、水化、蛋白封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB染色、苏木素复染核、脱水、透明、封片等步骤后，显微镜下观察。细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为染色阳性。参考Fromowitz半定量积分法［5］和相关文献［6-7］判定结果：随机观察5个400倍视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞比例≤10%为阴性，＞10%为阳性。结果由2名皮肤病理科医生判定。

3.统计学方法：采用SPSS18.0统计软件，卡方检验分析比较各组间TOX蛋白表达的阳性率，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

30份疑似MF病例中，26份（86.7%）TOX蛋白表达阳性，表现为表皮及真皮浅层散在TOX阳性细胞（图1A）。

23例确诊MF病例中，20份（87%）TOX蛋白表达阳性，3例阴性（2例为斑片期，1例为斑块期）。10例斑片期中8例表达TOX蛋白，表现为表皮内散在及真皮浅层较多TOX阳性细胞（图1B）；7例斑块期中6例表达TOX，表现为表皮内散在及真皮浅中层密集TOX阳性细胞（图1C）；6例肿瘤期病例均表达TOX蛋白，表现为表皮内散在及真皮全层大量TOX阳性细胞呈团块状浸润（图1D、1E），真皮内阳性细胞核大、深染，异形性明显（图1F）。

10份良性炎症性皮肤病标本中，3份TOX阳性（银屑病2例、慢性湿疹1例）（图1G、1H）。

卡方检验显示，疑似MF组和MF组TOX阳性率差异无统计学意义（χ2=0.000 95，P=0.975）；疑似MF组织中TOX阳性率明显高于良性炎症性皮肤病组（χ2=12.079，P=0.000 5），MF组亦高于良性炎症性皮肤病组（χ2=10.705，P=0.001）。

讨 论

TOX基因于 2002年由Wilkinson等［8］首次命名，他们发现处于分化阶段的小鼠CD4+和CD8+胸腺细胞中TOX基因表达明显升高。目前已证实，TOX基因与多种肿瘤相关，包括肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病等。2012年Zhang等［2］首次发现，TOX在早期MF皮损组织中的CD4+CD8-肿瘤T细胞中表达升高，在良性炎症性皮肤病以及正常皮肤中不表达，从而提出TOX可能是诊断早期MF的分子标志物。其后陆续有其他研究表明，TOX不仅表达于MF皮损组织中，在其他皮肤T细胞淋巴瘤、良性炎症性皮肤病甚至正常皮肤中均有所表达［9-10］。同时也有研究显示，TOX的表达不仅限于CD4+CD8-肿瘤T细胞中，在CD4-CD8+、CD4-CD8-和CD30+肿瘤T细胞中均可表达，甚至在部分皮肤B细胞淋巴瘤中也有表达［11］。因此有学者认为，TOX对于MF的诊断不具有特异性［7］。

图1 TOX蛋白在疑似和确诊蕈样肉芽肿（MF）及良性炎症性皮肤病（BID）组织中的表达（SP法） 1A：疑似MF标本中可见真皮浅层散在TOX阳性细胞（×25）；1B：斑片期MF皮损中可见真皮浅层较多TOX阳性细胞（×25）；1C：斑块期MF皮损中可见真皮浅中层密集TOX阳性细胞（×25）；1D：肿瘤期MF皮损中可见真皮全层大量TOX阳性细胞呈团块状浸润（×25）；1E：肿瘤期MF皮损中表皮内散在分布的TOX阳性细胞（箭头）（×100）；1F：肿瘤期MF皮损中真皮内可见密集TOX阳性细胞，这些细胞核大、深染，异形性明显（×400）；1G：部分BID皮损真皮浅层可见散在TOX阳性细胞，但染色较浅（×25）；1H：部分BID皮损不表达TOX，均为背景染色，细胞未着色（×25）

本研究发现，在不同阶段MF皮损中，TOX均有不同程度表达。与良性炎症性皮肤病组相比，MF组TOX表达阳性率明显增高。3份TOX表达阳性的良性炎症性皮肤病标本分别来自银屑病和慢性湿疹病例，结合既往报道，我们推测TOX并非特异地表达于肿瘤细胞中，在反应性T淋巴细胞中也可表达，但表达强度及表达率均偏低。我们还发现，疑似MF组TOX蛋白表达率明显高于良性炎症性皮肤病组，但与MF组相比差异无统计学意义。本文疑似MF病例虽然并未诊断为MF，但30份标本均可见不同程度异形淋巴细胞浸润，在这些异形细胞中部分可检测到TOX蛋白表达，此类细胞有可能是MF细胞，但仍需研究证实。

TCR基因重排是MF诊断及鉴别诊断的有效辅助方法［12］，但是由于早期MF皮损标本中肿瘤细胞较少，混杂有大量反应性炎症细胞，导致早期MF的T细胞受体基因重排（TCR-GR）检出率较低。本课题组前期尝试使用激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）制备DNA模板，LCM可在不破坏组织结构的前提下，直接获取更为纯净的目标细胞［13］，并成功证实，在疑似MF和确诊MF病例中，使用LCM法比传统氯-酚仿法制备DNA模板能检出更多的阳性病例，尤其是在早期MF病例中，所以认为LCM联合PCR技术检测TCR-GR是早期MF的有效辅助诊断手段［14］。

肿瘤细胞的克隆性增殖需要多种信号通路参与，目前已有研究证实，TOX可通过激活AKT和PI3K/AKT通路促进MF肿瘤细胞的增殖和播散，具有致癌作用。所以我们推测，TOX的表达与TCRGR之间具有正相关性，但目前尚无文献报道。

本实验63份标本中29份（15份疑似早期MF、8份典型MF、6份良性炎症性皮肤病）在早期由本课题组分别使用酚-氯仿法和LCM法制备DNA模板，用PCR检测TCR-GR［14］。将TOX蛋白表达情况分别与两种方法制备模板后进行的TCR-GR检测结果进行Pearson相关性分析显示，TOX蛋白表达与基于酚-氯仿法制备模板的TCR-GR检测结果无统计学相关性（r=1.00，P＞0.05），但与LCM法制备模板的TCR-GR检测结果呈正相关（r=0.493，P＜0.01）。

在临床上，有部分患者可检测到克隆性T细胞群，但缺乏MF的组织病理学特征，有学者将其称之为“克隆性皮炎”或者“发育不全/潜在淋巴瘤”［15-16］，长期随访显示，他们发展为MF的风险更高［16-17］。所以，尽早发现此类患者并进行早期干预显得尤为重要。尽管本课题组前期实验及大量文献均显示，LCM联合PCR技术可提高TCR-GR的检出率，有助于早期MF的诊断，但在实际工作中，由于LCM需要特殊的设备，所以临床应用受限，大部分医院尤其是基层医院仍使用传统方法制备DNA模板，以致TCR-GR仍存在漏检的现象，这对于早期MF及“克隆性皮炎”的患者来说，可能耽误其诊断及治疗。因此，针对这类患者需要寻找一些辅助标记以确定其是否为MF，或者MF的可能性。MF中TOX蛋白虽然特异性较差，但敏感性较好，本研究显示TOX蛋白表达与LCM检测的TCR-GR结果具有较好的正相关性，基于此，我们推测，在无法使用LCM对TCR-GR进行检测的情况下，TOX可作为替代手段对早期MF及“克隆性皮炎”患者进行筛查，对TOX表达阳性的患者，应提高警惕，进一步结合其他辅助检查方法进行判断，对仍不能确诊MF的患者，应加强随访。

总之，本研究显示，TOX在MF、疑似MF病例中的表达明显高于良性炎症性皮肤病，我们认为TOX可作为MF的分子标志物之一，敏感性较好，但特异性较差。MF尤其是早期MF的诊断仍面临巨大的挑战，目前尚无单一标准能够确诊，临床联系病理并结合免疫组化、分子生物学等其他辅助手段是诊断的关键，寻找更优化的诊断方法任重而道远。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突