Beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响

徐艳艳 王久江 张伶 韩昭 牛亮 张建忠 刘钊

李改静 李小兵 刘晴 刘志军 李小静

河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸 056002

皮肤恶性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）侵袭性强，易发生血液和淋巴管转移，5年生存率仅为10.9%，黑素瘤细胞的恶性生物学行为是影响患者预后的重要因素［1-2］。Beclin1作为自噬核心复合物关键蛋白，被认为是潜在的抑癌基因［3］。前期研究显示，Beclin1蛋白可能抑制黑素瘤瘤体生长［4-6］，苏远婷等［7］发现，黑素瘤组织Beclin1蛋白表达低于黑素瘤周边的正常表皮细胞。本实验中我们以上调Beclin1表达水平为切入点，在细胞水平上进一步探讨Beclin1对黑素瘤的影响，以期对开发针对恶性黑素瘤的靶向药物奠定实验基础。

材料与方法

一、主要材料

人黑素瘤细胞株A375、SK-MEL-2来自中国医学科学院细胞库。Beclin1抗体产自英国Abcam公司；羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶产自美国Abbkille公司；全蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒均为上海碧云天生物技术公司产品；转染所用质粒pcDNA.3.1/myc-His（-）A、pcDNA3.1-Beclin1质粒均由中国凯基生物有限公司构建并测序，Beclin1基因编号为AF139131.1；转染试剂Lipo3000为美国Invitrogen公司产品；Transwell小室为美国Corning公司产品；CCK8试剂盒为日本Dojindo Laboratories公司产品。

二、方法

1.细胞准备：取出冻存的人黑素瘤细胞株A375、SK-MEL-2复苏，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中常规培养和传代，培养至2代以上消化吹打混匀成细胞悬液。

2.Western印迹筛选低表达Beclin1的黑素瘤细胞株：取上述细胞悬液离心后弃上清液，37℃消化。取细胞悬液洗涤后裂解细胞，离心15 min，取上清液用BCA蛋白含量检测试剂盒测定样品蛋白浓度。取上清液与上样缓冲液混合后100℃水浴5 min，室温冷却，每孔取60 μg样品上样，电泳，转印硝酸纤维素膜，封闭1 h。以3-磷酸-甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参，加入一抗（稀释比例1∶2 000）孵育Beclin1过夜，加入羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶二抗（稀释比例1∶6 000）孵育2 h。ECL化学发光和与X线片定影。使用Gel-Pro32软件对条带灰度值以Beclin1与GAPDH灰度值比值表示Beclin1的相对表达量。实验重复3次。

3.细胞转染及鉴定：取SK-MEL-2细胞悬液培养至密度达到50%～70%时进行质粒转染。将细胞分为3组，空白组不做处理，阴性对照组转染pcDNA.3.1/myc-His（-）A，实验组转染pcDNA3.1-Beclin1质粒。将3 μg稀释好的目的质粒和转染液等量混匀，室温孵育5 min，加入细胞培养孔中，培养48 h后，G418筛选单克隆细胞。Western印迹检测各组细胞Beclin1的表达（方法同前）。实验重复3次。

4.CCK8试剂盒检测细胞增殖抑制水平：将上述3组细胞培养2周后进行消化、计数，向96孔细胞培养板中每孔接种5×103个细胞。用含10%胎牛血清的培养基培养24、48、72 h；在每个时间节点，弃原培养液，每孔加入含有10 μl CCK8的完全培养基培养3 h，在多功能酶标仪上测定每孔450 nm波长下吸光度（A450值）。绘制增殖曲线，增殖率=不同时间点A450值/初始A450均值×100%。每组设置6个复孔。

5.Tanswell小室法检测细胞侵袭能力：在Transwell上室加入稀释融化的Matrigel胶，37℃静置2 h，将上述3组细胞饥饿培养24 h后消化、计数。向小室中加入100 μl细胞悬液，细胞数为1×104/室，将小室置入含有500 μl/孔完全培养基的培养板中培养24 h；拭去基质胶和小室内细胞，对小室底部细胞予用0.1%结晶紫染色30 min，PBS洗涤3次，200倍显微镜下随机取3个视野，计数。实验重复3次。

6.划痕法检测细胞迁移能力：取上述3组对数生长期细胞消化接种至6孔板培养12 h，细胞汇合度达60%左右时，为排除细胞增殖引起的误差，加入适量丝裂霉素培养1 h后换新鲜培养液，培养2 h，然后，用无菌枪头垂直在6孔板中均匀划线，PBS洗去漂浮细胞，继续培养。分别于培养0、24、48 h后拍照，测量细胞迁移距离。细胞迁移距离=0 h划痕宽度-某时间点划痕宽度。实验重复3次。

7.统计学处理：采用SPSS23.0统计软件分析，实验数据以±s表示，数据符合方差齐性时，采用完全随机设计方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两株黑素瘤细胞Beclin1表达水平

SK-MEL-2细胞Beclin1相对表达水平为0.037±0.010，明显低于A375细胞（0.670±0.150），差异有统计学意义（F=46.62，P＜0.05）。见图1。

二、转染后SK-MEL-2细胞Beclin1蛋白表达水平

Western印迹检测显示，转染48 h后，3组间Beclin1蛋白表达差异有统计学意义（F=81.38，P＜0.05），其中，实验组为0.32±0.04，明显高于空白组（0.07 ± 0.02，t=1.08，P＜0.05）和阴性对照组（0.06± 0.02，t=1.13，P＜0.05），空白组和阴性对照组间差异无统计学意义（t=0.04，P＞0.05）。见图2。

三、转染后SK-MEL-2细胞体外增殖能力比较

图1 Western印迹检测A375和SK-MEL-2细胞Beclin1蛋白表达 Beclin1蛋白在SK-MEL-2中显著低表达。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脱氢酶

图2 Western印迹检测SK-MEL-2细胞转染后Beclin1蛋白表达 实验组Beclin1蛋白表达明显高于空白组和阴性对照组。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脱氢酶

重复测量的方差分析显示，空白组、阴性对照组、实验组间细胞增殖率差异有统计学意义（F组间=1 077.36，P＜0.05），各组内不同时间点间差异亦有统计学意义（F时间=4 903.04，P＜0.05），组别和时间有交互作用（F交互=205.20，P＜0.05）。培养24、48、72 h时，3组间细胞增殖率差异均有统计学意义（F值分别为1 012.89、10 227.34、13 826.12，均P＜0.05），且随着时间延长，细胞增殖率逐渐升高，实验组增殖率低于空白组和阴性对照组（P＜0.05）。见图3。

四、转染后各组SK-MEL-2细胞侵袭力比较

Transwell实验显示，24 h后3组间每高倍（×200）视野下穿过小室的细胞数差异有统计学意义（F=128.93，P＜0.05），实验组（18.67±1.19）明显低于阴性对照组（87.89± 6.05，t=33.53，P＜0.001）和空 白 组（86.78 ± 5.93，t=32.99，P＜0.001）。见图4。

五、转染后各组SK-MEL-2细胞迁移活性比较

划痕实验显示，3组间细胞迁移距离在24 h（F=45.25，P＜0.05）和48 h（F=66.66，P＜0.05）时差异均有统计学意义，实验组在上述时间点均显著低于空白组（P＜0.05）和阴性对照组（P＜0.05）。见图5。

讨 论

Beclin1蛋白是调控自噬的关键标志蛋白［7］，在各种应激因素刺激下，Beclin1和Bcl-2蛋白分离，Beclin1蛋白的结合位点进化保守结构域（ECD）与Ⅲ型PI3K中的亚基Vps34结合，诱导吞噬泡形成，从而启动自噬［8-10］。研究发现，Beclin1不仅能启动自噬，Beclin1功能结构域还能和自噬相关调节因子结合，对肿瘤产生抑制作用。

图3 转染后SK-MEL-2细胞增殖活性比较 各时间点实验组细胞增殖率显著低于空白组和阴性对照组。a：两组间比较，P＜0.05

图4 Transwell小室法检测转染后各组SK-MEL-2细胞侵袭能力 实验组穿过小室的细胞数少于其他两组

图5 划痕实验检测各组SK-MEL-2细胞迁移活性 5A：显微镜下观察细胞迁移情况；5B：细胞迁移距离统计学比较。实验组24、48 h迁移能力明显下降。a：两组间比较差异有统计学意义，P＜0.05

在前期研究中［4-5］我们发现，丹参酮ⅡA能体外诱导A375细胞自噬，使自噬相关蛋白Beclin1表达显著升高，同时抑制A375细胞生长能力。随后在小鼠黑素瘤动物模型中［6］发现，丹参酮ⅡA能使Beclin1表达上调，通过诱导自噬抑制黑素瘤瘤体生长，提示在黑素瘤中Beclin1蛋白可能作为抑癌蛋白存在。本研究中，我们通过Western印迹技术筛选出Beclin1低表达的SK-MEL-2细胞株作为研究对象，通过脂质体转染法，成功构建Beclin1过表达细胞系，研究Beclin1表达上调对SK-MEL-2细胞恶性生物学行为的影响。结果显示，Beclin1表达上调后SK-MEL-2细胞增殖能力明显减弱，侵袭能力下降。但迁移距离可能受细胞增殖的影响，本实验在划痕实验前，预先将细胞经丝裂霉素C处理以排除细胞增殖引起的误差，结果表明，Beclin1表达上调后，SK-MEL-2细胞迁移能力明显减低。Hu等［11］发现，Beclin1蛋白过表达可有效抑制舌上皮细胞的增殖和克隆，还发现Beclin1表达下降和晚期肿瘤临床转移及预后不良显著相关。然而有学者提出，在肿瘤化疗期间，Beclin1蛋白下调可以增加化疗药物的敏感性［12］。推测这可能与自噬在调控肿瘤的作用中存在阶段性有关。

已有研究证实，前列腺癌［13］、结肠癌［14］中Beclin1蛋白低表达。本课题组前期也发现，皮肤恶性黑素瘤组织中Beclin1蛋白表达量明显低于色素痣组织，Beclin1可能为抑癌基因。祁璘等［15］发现，Beclin1蛋白在宫颈癌表达降低，并提出Beclin1的降低直接促进肿瘤细胞增殖活性。但Bealin1抑制黑素瘤进程的具体机制尚不明确。Beclin1可依赖自噬诱导细胞凋亡、清除受损的基因组和活性氧［16-17］、减少炎症物质［18］等机制来抑制肿瘤发生和转移。Wei等［19］提出，Beclin1可有效诱导自噬，抑制肿瘤进程。除了Beclin1依赖自噬发挥抑癌作用，Xu等［20］发现了Beclin1可不依赖自噬，直接与DNA拓扑异构酶Ⅱβ相互作用，抑制肿瘤的发生。Wu等［21］设计出能与Beclin 1卷曲螺旋结构域的C端部分的碳氢化合物靶向作用的结合肽，能通过促进Beclin1自噬核心复合物之间的相互作用，以干扰其同聚体化，诱导自噬，说明以Beclin 1为靶点调控膜介导的自噬和体内运输可行性。

综上所述，Beclin1过表达对SK-MEL-2细胞的恶性生物学行为起抑制作用，在黑素瘤中可能起抑癌作用。由于自噬的复杂性和阶段性，Beclin1、自噬和黑素瘤之间的具体作用机制还需在后续实验中进一步探索。本研究选取低表达细胞株时仅测定了两种细胞株Beclin1表达量，后续将增加细胞株数量并通过干扰Beclin1表达进行反向验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突