MTHFR基因多态性及血浆Hcy水平在脑卒中诊断中的临床应用

邓爱凤，梁丽萍，张光辉

深圳恒生医院检验科，广东 深圳 510180

脑卒中是一种脑血管意外，又称中风，是由遗传因素及环境因素等多种诱发因素所共同作用导致的一种永久性的脑功能障碍，临床表现为脑部供血受阻，导致患者脑部动脉狭窄、闭塞、破裂，引发急性脑血压循环异常，临床上具有较高的发病率、病残率及病死率[1-2]。根据相关临床资料显示，中国脑卒中患者病死率为58/10万～142/10万，是导致人类死亡的三大死因之一，严重影响人们的生命健康[3]。因此，对脑卒中病因的研究以及预防成为临床治疗研究的重点。根据临床研究显示，脑卒中的发病与高同型半胱氨酸 (Hcy) 血症密切相关，是引发脑卒中的独立性危险因素[4]。叶酸、维生素B12或维生素B6摄入量过少或代谢过程中酶或因子发生异常，易引发高Hcy 血症。影响高Hcy 血症的众多因素中较为重要的代谢关键酶是N5、N10亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR) ，MTHFR 多基因多态性对酶的特异活性作用很大，当MTHFR基因突变时，导致MTHFR酶活性降低，使Hcy浓度升高及DNA 低甲基化，从而导致轻度或中度高Hcy血症，引发多种疾病[5-6]。本文回顾性分析脑卒中患者中血浆MTHFR基因多态性及HCY、叶酸、维生素B12水平的变化，并探讨其对脑卒中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年6 月至2019 年6 月在深圳恒生医院接受治疗且符合脑卒中临床诊断标准的患者300 例作为观察组，其中缺血性脑卒中181例，出血性脑卒中119 例；另选择同期体检健康者300例作为对照组。纳入标准：①脑卒中患者均符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南标准，并经CT 或MRI 检查确诊；正常健康体检者均符合无血缘关系且无其他脑梗死或脑血管疾病症状；②近期 (1个月内) 无感染症状且未使用影响血浆Hcy水平的药物，如甲氨蝶呤、叶酸以及B族维生素类代谢等；③无占位性病变者。排除标准：①合并冠心病、糖尿病等疾病者；②具有心源性脑栓塞、肝肾功能严重不全及恶性肿瘤等疾病者；③甲状腺功能损伤、免疫性疾病或血液系统疾病者；④具有长时间贫血史或胃溃疡病史者。两组受检者的一般资料比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) ，具有可比性，见表1。

表1 两组患者的基本资料比较[例 (%) ]

1.2 观察指标 (1) 两组受检者的血浆Hcy水平、叶酸、维生素B12水平及收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白 (LDL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 等指标； (2) 两组受检者的血浆MTHFR 基因多态性分型以及不同基因分型者的血浆Hcy水平； (3) 两组受检者血浆MTHFR基因型及等位基因频率分布情况。

1.3 检测方法

1.3.1 血浆Hcy、叶酸、维生素B12水平测定 循环酶法测定Hcy，取所有受检者空腹静脉血5 mL，采血须一次成功，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，抗凝处理10 min 后，采用2%乙二胺四乙酸二钠100 μL 进行分离，4℃3 000 r/min 离心分离上层血浆，标本置于-70℃环境保存待测；检测仪器采用日本Hitch 7080全自动生化分析仪，德国西门子公司提供的相关试剂盒，根据操作说明测定Hcy水平；采用德国西门子公司ADVIA Centaur XP 全自动免疫分析仪及相关试剂盒测定叶酸、维生素B12。血浆Hcy 浓度小于10 μmol/L时为正常值，10 μmol/L以上为高Hcy 血症。

1.3.2 MTHFR 基因分型检测 (1) 首先需提取DNA，取所有受试者静脉血2 mL，经EDTA抗凝处理，根据DNA 提取试剂操作说明方法完成提取和纯化，样本DNA 置于-20℃保存，冻融小于3 次； (2) 其次对纯化后的DNA 标本进行PCR 扩增，适用0.2 mL 的扩增反应管分装MTHFR扩增液，扩增反应体系共25 μL (19 μL 扩增液、1 μL 反应液、5 μL DNA 模板) ，在94℃中预变10 min，进行95℃变性30 s、57℃退火45 s、72℃延伸45 s循环25次，在72℃延伸5 min时停止；扩增后置于2℃～8℃环境保存； (3) 最后进行杂交、显色，取出扩增液产物10 μL 与杂交缓冲液进行混合，取抗体1支进行低速离心，对抗体进行稀释，取出标记好的MTHFR基因芯片进行杂交，采用基因芯片图像分析软件进行扫描图像，分析数据，观察MTHFR 677 位点的等位基因，分别定义为C/C、C/T、T/T三种分型。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的血浆Hcy水平等指标比较 观察组患者的血浆Hcy水平明显高于对照组，叶酸、维生素B12水平明显低于对照组，差异均具有统计学意义 (P＜0.05) ；观察组患者收缩压明显高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05) ，但舒张压、总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL组间比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) ，见表2。

表2 两组受检者的血浆Hcy水平等指标比较

表2 两组受检者的血浆Hcy水平等指标比较

注：1 mmHg=0.133 kPa。

组别例数观察组对照组t值P值300 300 Hcy (μmol/L) 19.89±8.78 12.88±5.93 11.459 9＜0.05叶酸 (ng/mL) 5.62±1.34 7.32±3.53 7.798 4＜0.05维生素B12 (pg/mL) 347.82±125.32 476.43±122.65 12.703 6＜0.05收缩压 (mmHg) 150.22±25.24 130.43±12.54 12.162 2＜0.05舒张压 (mmHg) 85.62±13.44 84.43±15.43 1.007 3 0.314 2总胆固醇 (mmol/L) 6.47±2.36 6.72±1.13 1.654 9 0.098 5甘油三酯 (mmol/L) 1.62±0.24 1.59±0.64 0.760 2 0.4474 LDL (mmol/L) 4.42±2.55 4.32±2.63 0.472 8 0.636 5 HDL (mmol/L) 1.32±0.48 1.33±0.43 0.268 8 0.788 2

2.2 两组受检者的血浆MTHFR基因分布频率比较 经Hardy-Weinberg平衡定律检测观察组MTHFR等位基因分布的频率，其中C/C、C/T、T/T 实际频数分别为90、129、81，预计频数分别为89、131、80，数据均符合平衡定律 (χ2=3.347 8，P=0.067 5) ，表示均来自孟德尔群体。观察组C/C基因型频率及C等位基因频率明显低于对照组，T/T 基因型频率及T 等位基因频率明显高于对照组，差异均具有统计学意义 (P＜0.05) ；观察组患者的C/T 基因型频率略高于对照组，但差异无统计学意义 (P＞0.05) ，见表3。

表3 两组受检者的血浆MTHFR基因分布频率比较[例 (%) ]

2.3 两组受检者的不同基因分型血浆Hcy水平比较 两组受检者的T/T基因型血浆Hcy水平明显高于C/C、C/T 基因型，差异均具有统计学意义 (P＜0.05) ；观察组患者的C/C、C/T、T/T基因型血浆Hcy水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义 (P＜0.05) ，见表4。

表4 两组受检者的不同基因分型血浆Hcy水平比较，μmol/L)

表4 两组受检者的不同基因分型血浆Hcy水平比较，μmol/L)

注：与T/T基因型比较，aP＜0.05。

组别观察组对照组t值P值例数300 300 C/C 14.89±4.78a 12.88±4.93a 5.069 9＜0.05 C/T 16.62±4.34a 13.32±3.53a 10.217 1＜0.05 T/T 26.82±7.32 24.43±5.65 4.476 8＜0.05

3 讨论

脑卒中即脑血管疾病患者因遗传因素、环境因素等多种因素诱发，导致患者脑血管出现供血不足、闭塞或破裂现象，脑功能严重损伤，且脑卒中病情发展迅速，发病率高且发病后具有较高的致死率[7]。因此，近些年有关脑卒中的预防和评估一直是临床治疗脑卒中研究的热点。根据有关资料显示，高HCY血症是形成血栓的独立危险因素，可能机制是HCY升高能够造成内皮细胞损伤，平滑肌细胞质增殖，血小板活性增强，通过氧化应激反应，凝血激酶升高，抗凝血蛋白下降，从而促进脑卒中病情的产生和发展[8-9]。

本研究结果显示，脑卒中患者与正常健康受试者的血压状况及总胆固醇、甘油三酯、LDL、HDL 差异无统计学意义，而脑卒中患者的血浆Hcy 明显较高，而叶酸、维生素B12水平明显较低。研究结果证实了上述理论，这提示当机体Hcy 水平升高时会导致生成氧自由基，血管内皮细胞受损，从而使一氧化氮和前列环素合成降低，低密度脂蛋白氧化，血小板功能障碍，形成泡沫细胞，抑制脑血管动脉弹性，从而使血管阻力加大，增加脑血管血栓的风险。同时，叶酸、维生素B12水平作为辅酶一旦缺乏也会导致Hcy水平升高，极易引起血管栓塞性事件的发生，这可能在于血浆Hcy 作为一种中间产物氨基酸，作用于人体甲硫氨酸循环中，主要通过再甲基化和转硫两种途径完成代谢过程，完成代谢过程需要MTHFR、叶酸、辅酶维生素B12共同作用。

此外，本研究发现MTHFR 基因多态性分布频率，结果显示脑卒中患者相较于正常健康者具有更高的T/T基因型频率及T等位基因频率，而C/C基因型频率及C等位基因频率显著较低。这提示血浆Hcy代谢过程以5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，能够经MTR 作用重新合成甲硫氨酸，其中叶酸是转化5-甲基四氢叶酸的关键成分，MTHFR 能够催化形成5、10-亚甲基四氢叶酸还原成N5-甲基四氢叶酸，因此MTHFR基因是Hcy 代谢中的关键酶。MTHFR 基因常见的酶缺陷是指MTHFR基因序列677 位点的点突变，发生由C 到T 的变化，导致丙氨酸变为缬氨酸，使MTHFR 酶活性降低约65%，与叶酸结合能力下降，增加血栓形成风险[13-14]。一旦MTHFR出现含量不足或活性降低，引发Hcy代谢不足，体内聚集，Hcy升高，引起高Hcy血症，从而导致脑卒中风险升高[15]。

根据临床研究资料，C/C基因型的MTHFR酶的活性最高，C/T 基因型的活性中等，活性约为正常的65%，T/T基因型活性最低，活性约为正常的30%[18-19]。本研究结果证实了上述理论，根据不同基因分型Hcy 水平结果显示，T/T 基因型血浆Hcy 水平明显高于C/C、C/T 基因型，同时脑卒中患者的三种分型的血浆Hcy 水平均高于正常健康者，这提示脑卒中MTHFR基因的活性下降，导致Hcy再甲基化作用过程中出现代谢障碍，Hcy 水平升高，从而增加脑卒中的风险[20]。

综上所述，血浆MTHFR基因多态性、Hcy 水平与脑卒中的发生具有一定的关系，临床上检测两种指标可以有助于及时提供针对性的预防和个体化治疗方案。