三叶青不同萃取部位抗氧化活性

何文，李瀚鑫，王晰雯，叶春林

浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室（杭州 310023）

三叶青（Tetrastigmatis hemsleyani）又名石猴子、石抱子、石老鼠、蛇附子、丝线吊金钟、金线吊马铃薯等，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg）[1-2]。它主要分布于我国浙江、安徽、西藏、江西、湖南等地[3]。据记载，三叶青味微苦、性平，具有清热解毒、活血散瘀、祛风化痰的功效[4-5]。内服主治白喉、痢疾、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、支气管炎及肝炎，外用主治跌打损伤、扁桃体炎、淋巴结结核、子宫颈炎，还可用于毒蛇咬伤[6]。研究表明，三叶青具有广泛的生物活性，比如具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等功效[3]，有着“植物抗生素”的美誉，近几年逐渐受到国内外学者的关注。

机体在代谢过程中能够源源不断地产生自由基，同时自由基也能够不断地被清除。在正常情况下，这两种过程维持在一个动态平衡的状态，这种状态能够使机体保持平衡稳定的自由基含量[7]。自由基含量过多，会导致机体的正常细胞和组织受到非特异性氧化损伤，从而引发多种恶性疾病，如心血管病、糖尿病、早老性痴呆、关节炎、癌症等[8]，几乎被认为与机体自由基含量失衡有关。中药中富含天然的抗氧化剂，其包含的活性成分能够抑制自由基的产生，或者直接参与对抗自由基对人体细胞及组织的伤害[9]。

基于此，试验通过测定三叶青三个萃取部位对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除能力以及对铁离子的还原能力，来评价三叶青三个萃取部位的抗氧化活性，并通过测定三个萃取部位中总酚和总黄酮含量以及分析总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性，初步判断其抗氧化作用的物质基础，为中药三叶青的进一步开发与利用提供一定的理论基础。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂

三叶青块根（浙江丽水三叶青珍稀植物研究所）；三羟甲基氨基甲烷、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、FeSO4·7H2O（天津市大茂化学试剂厂）；邻苯三酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；盐酸、铁氰化钾、三氯化铁、没食子酸、芦丁、水杨酸、福林酚、碳酸钠（上海凌峰化学试剂有限公司）；1, 1-二苯基苦基苯肼（DPPH，北京冬歌生物科技有限公司）；三氯乙酸、无水乙醇（永华化学科技有限公司）；30% H2O2溶液（杭州高晶精细化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

CS-700高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）；DKS-24型电热恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂）；752紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；BCD-212型冰箱（博西华家用电器有限公司）；9070MBE型数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

2 试验方法

2.1 三叶青不同萃取部位样品的制备

用70%甲醇浸泡三叶青块根粉末，得到三叶青甲醇提取物，经减压浓缩后得到浸膏，系统溶剂萃取法对浸膏依次进行萃取，得到各个萃取部位。分别称取500 mg各极性部位，石油醚部位、乙酸乙酯部位用无水乙醇溶解，正丁醇部位用去离子水溶解，定容于100 mL容量瓶中，配成终浓度为5.0 mg/mL的母液，再分别稀释成不同浓度梯度的溶液，作样品液；配制相同浓度的VC溶液，备用。

2.2 总酚含量的测定

将每个萃取部位配制成2.0 mg/mL的溶液，从中取出0.5 mL，采用福林酚比色法[10]测定三叶青不同萃取部位总酚含量。

2.3 总黄酮含量的测定

将每个萃取部位配制成2.0 mg/mL的溶液，从中取出0.5 mL，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[11]测定三叶青不同萃取部位总黄酮含量。

2.4 三叶青不同萃取部位抗氧化活性测定

2.4.1 DPPH自由基清除率测定

分别吸取2.0 mL系列质量浓度样品溶液，加入2.0 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液，混合均匀，常温下在暗处放置30 min。无水乙醇调零，测定溶液在517 nm波长处的吸光度A1；然后用无水乙醇替代样品溶液后测定吸光度A0，替代DPPH标准液后测定吸光度A2。VC作对照，每个样品重复3次，按式（1）计算DPPH自由基清除率[12]。

式中：A0表示DPPH标准溶液+无水乙醇的吸光度；A1表示DPPH标准溶液+样品液的吸光度；A2表示无水乙醇+样品液的吸光度。

2.4.2 超氧阴离子清除率测定

在10 mL试管中依次加入1.0 mL不同质量浓度的样品液、4.0 mL 50 mmol/L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液，在25 ℃下恒温水浴10 min，再加入0.1 mL 20 mmol/L的邻苯三酚，混匀保温4 min后，立即加入2滴浓盐酸（12 mol/L）终止反应，在325 nm波长下测定溶液的吸光度A1，用0.1 mL去离子水替代邻苯三酚后测定吸光度A2，1.0 mL去离子水替代样品溶液后测定吸光度A0，以VC作为对照，平行试验3次，取平均值，按照式（2）计算超氧阴离子自由基清除率[13]。

式中：A0表示去离子水+Tris-HCl缓冲液+邻苯三酚的吸光度；A1表示样品液+Tris-HCl缓冲液+邻苯三酚的吸光度；A2表示样品液+Tris-HCl缓冲液+去离子水的吸光度。

2.4.3 羟自由基清除率测定

移取1.0 mL 6.0 mmol/L FeSO4于10 mL的试管中，加入1.0 mL 6.0 mmol/L水杨酸乙醇溶液、1.0 mL不同质量浓度的样品液，最后加入1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液启动反应，在37 ℃恒温水浴反应30 min，在510 nm波长处测吸光度Ai，去离子水替代H2O2溶液测定吸光度Aj，去离子水替代样品液测定吸光度A0。VC作为阳性对照，每个样品重复3次，取平均值，按照式（3）计算羟自由基清除率[14]。

式中：Ai表示1.0 mL FeSO4+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL样品液+1 mL H2O2的吸光度；Aj表示1 mL FeSO4+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL样品液+1 mL去离子水的吸光度；A0表示1 mL FeSO4+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL去离子水+1 mL H2O2的吸光度。

2.4.4 铁离子还原能力测定

取2 mL各质量浓度的样品液，分别依次加入2 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和2 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后50 ℃恒温反应20 min，急速冷却，加2 mL 10%的三氯乙酸，混匀后4 000 r/min离心10 min。取2 mL上清液，分别加2 mL去离子水和0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10 min 后，去离子水调零，在700 nm波长处测定吸光度。VC溶液为阳性对照，每个样品重复测3次，取平均值[15]。

2.5 数据统计分析

所有结果均以X±S表示。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，并结合Duncan法检验各数据间的差异显著性，p＜0.05表示差异显著。利用Pearson correlation test法进行各数据间的相关性分析。

3 结果与分析

3.1 没食子酸、芦丁标准曲线

以质量浓度为横坐标X（μg/mL），吸光度为纵坐标Y，得到没食子酸标准曲线方程：Y=0.093 1X+0.068，R2=0.999 4。芦丁标准曲线方程为：Y=0.007 7X+0.009 4，R2=0.999 3。

3.2 三叶青不同萃取部位中的总酚、总黄酮含量分析

由表1可知，总酚和总黄酮含量在三叶青不同萃取部位中具有明显的差异：其中乙酸乙酯部位的总酚、总黄酮含量最高，石油醚部位次之，正丁醇部位总酚、总黄酮含量最低。利用单因素方差分析和Duncan法检验这三种萃取部位总酚、总黄酮含量间差异的显著性。结果显示，任意两种部位之间的总酚、总黄酮含量均具有显著性差异（p＜0.05），三个部位中总酚、总黄酮含量的大小顺序一致，均为乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位，可以认为三叶青中的酚类物质和黄酮类化合物基本富集在乙酸乙酯部位和石油醚部位，通过分步萃取，已初步提取出三叶青中的酚类物质和黄酮类物质。

表1 三叶青不同萃取部位中的总酚、总黄酮含量（X±S，n=3） mg/g

3.3 DPPH自由基清除能力分析

如图1所示，三叶青不同萃取部位及VC对DPPH自由基表现出不同程度的清除能力。在0.2～1.2 mg/mL质量浓度范围内，三叶青不同萃取部位对DPPH自由基的清除率均随其质量浓度的增大而增大，但均小于VC对DPPH自由基的清除率。由表2可知，三种不同萃取部位对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）由小到大的顺序为乙酸乙酯部位＜石油醚部位＜正丁醇部位，三者之间具有显著性差异（p＜0.05）。在试验浓度范围内，VC对DPPH自由基的清除率均在90%以上，无法求出其IC50值。故三叶青的三种不同萃取部位对DPPH自由基的清除能力为乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位，但均不及VC。

3.4 超氧阴离子清除能力分析

如图2所示，三叶青不同萃取部位及VC对超氧阴离子自由基的清除能力差异很大。在0.2～1.2 mg/mL质量浓度范围内，三叶青石油醚和乙酸乙酯部位对超氧阴离子自由基的清除率均随其质量浓度的增大而显著增大。正丁醇部位的清除能力随质量浓度的增大而提升幅度较低，在最高浓度1.2 mg/mL时也未能超过50%；VC对超氧阴离子自由基有着极强的清除能力，在最低浓度0.2 mg/mL时就超过了90%，故这二者均无法求出其IC50。由表2可知，三叶青乙酸乙酯部位的IC50小于石油醚部位，乙酸乙酯部位对超氧阴离子自由基的清除能力强于石油醚部位，但均不及VC。

图1 三叶青不同萃取部位对DPPH自由基的清除能力

表2 三叶青不同萃取部位对自由基的半抑制浓度（IC50，X±S，n=3） mg/mL

图2 三叶青不同萃取部位对超氧阴离子的清除能力

3.5 羟自由基清除能力分析

如图3所示，三叶青不同萃取部位及VC均对羟自由基有一定的清除能力。在0.05～4.0 mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增大，三叶青不同萃取部位及VC对羟自由基的清除率先增大再趋于平缓。其中石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位在2.0 mg/mL后清除率增幅不明显，而VC在0.5 mg/mL后清除率就基本不变。由表2可知，三种不同萃取部位及VC对羟自由基的半抑制浓度（IC50）顺序为VC＜乙酸乙酯部位＜石油醚部位＜正丁醇部位，任何两者之间差异显著（p＜0.05）。三种不同萃取部位对羟自由基的清除能力为：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位，但均不及VC。

图3 三叶青不同萃取部位对羟自由基的清除能力

3.6 铁离子还原能力

如图4所示，在0.025～0.15 mg/mL质量浓度范围内，三叶青不同萃取部位对铁离子还原能力均随其质量浓度的增大而略有上升，但均处于较低水平，而VC对铁离子还原能力随其质量浓度的增大而显著上升，且三种不同萃取部位对铁离子还原能力始终远低于VC。

图4 三叶青不同萃取部位对铁离子还原能力

3.7 总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

为评价三叶青不同萃取部位总酚、总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性，试验利用Pearson法进行了相关性分析，结果如表3所示。总酚含量与羟自由基清除能力的相关性达到了0.998，且显著相关（p＜0.05），说明总酚类物质是三叶青不同萃取部位清除羟自由基的主要活性成分。总黄酮含量与DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力的相关性达到了0.997和0.999，且显著相关（p＜0.05），说明总黄酮类物质是三叶青不同萃取部位清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的主要活性成分。综合所有相关系数来看，酚类、黄酮类化合物可能是三叶青不同萃取部位抗氧化活性的物质基础。

表3 三叶青不同萃取部位总酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性

4 结论与讨论

试验证明了三叶青的三个萃取部位均含有酚类和黄酮类化合物，其中乙酸乙酯部位的总酚、总黄酮含量最高，分别为39.31±0.79和177.40±2.98 mg/g；石油醚部位含量低于乙酸乙酯部位，分别为28.14±0.59和148.83±1.80 mg/g；正丁醇部位总酚、总黄酮含量最低，分别为21.37±0.47和42.34±1.15 mg/g。抗氧化活性试验证明，三叶青三个萃取部位均具有一定的清除自由基的能力和铁离子还原能力，其抗氧化的能力为乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位，但均不及VC。相关性分析证明三叶青三个萃取部位的抗氧化活性与它们的总酚、总黄酮含量大小显著相关，说明酚类和黄酮类可能是其抗氧化作用的物质基础，这与王维华[16]对三叶青体外抗氧化活性的研究结果相符。后续可考虑从三叶青乙酸乙酯和石油醚萃取部位分离纯化出有关单体化合物，进而筛选出其具体的抗氧化活性成分，为三叶青的进一步开发利用提供一定的理论基础。