不同发酵工艺对大球盖菇酵素质量的影响

梅子龙，陈润杰，杨锟，王旺，陈欢，龚大春,

1. 三峡大学湖北省生物酵素工程技术研究中心（宜昌 443002）；2. 三峡大学生物催化重点实验室（宜昌 443002）

酵素产品含有丰富的酶类、维生素、矿物质及多种生物活性成分，不仅可以促进机体正常的新陈代谢、延缓衰老、提供养分、修复细胞、净化血液，还能增强消化功能和营养物质吸收功效，在预防人类疾病方面具有重要意义[1-3]。研究表明，不同发酵方式对酵素的品质有很大影响。李建强等[4]以多种水果为原料，研究了自然发酵工艺和三级发酵工艺差别；莫大美等[5]研究了复合菌对酵素质量的影响，结果显示在发酵过程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌对酵素SOD活性有明显的提高作用。

大球盖菇是一种利用农作物秸秆制作的大型真菌，富含蛋白质、多糖、矿质元素、维生素等生物活性物质，氨基酸含量达17种，人体必需氨基酸齐全[6]，具有治疗或改善人体多种疾病之功效，堪称是色鲜味美的全营养保健食品。大球盖菇种植对土壤和气候要求不高，非常适合精准扶贫和农村农作物秸秆资源化利用。随着大球盖菇在农村地区大面积推广，除了鲜食外，如何将其进一步深加工为食用酵素产品或者其他储存期长的产品，将是大球盖菇产业发展的重点。

为了延长大球盖菇的产业链，试验研究了3种不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品的影响，对其发酵过程清除自由基能力、主要产酶酶活及有机酸含量进行了检测。此次试验对于大球盖菇的深加工和大面积推广具有重要意义。目前这方面研究在国内尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与试剂

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC（China Center of Industrial Culture Collection）。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；蔗糖、乳糖、木糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）；所有化学试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

种子培养基成分（g/L）：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

斜面保藏培养基（g/L）：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，琼脂20。

1.1.3 主要仪器与设备

MX-307冷冻离心机（天美）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技）；SX-700 灭菌锅（上海天美）；UV-1800分光光度计（日本岛津）；自制1 L酵素发酵罐；5 L上海保兴三联式发酵罐；30 L全自动灭菌发酵罐（德国贝朗）；LC5090高效液相（浙江福立）；等。

1.2 试验方法

1.2.1 3种发酵方式及主要流程

以大球盖菇为主要原料，分别采用自然发酵（1号罐）、酵母菌-德氏乳杆菌保加利亚亚种-嗜热链球菌先后顺序接种发酵（2号罐）、酵母菌-长双歧杆菌-嗜热链球菌先后顺序接种发酵（3号罐）3种工艺制备大球盖菇酵素，总时间为110 d。

1号自然发酵（1号罐）：大球盖菇原料→清洗，消毒→晾干，切片→装桶，压紧→加白糖→常温发酵（110 d）→酵素→ 过滤→装瓶→成品。

2号接种发酵（2号罐）：大球盖菇原料→清洗，消毒→晾干，切片→装桶，压紧→加白糖→植入酵母菌→常温发酵（50 d）→植入德氏乳杆菌保加利亚亚种→45 ℃发酵（30 d）→植入嗜热链球菌→47 ℃发酵（30 d）→酵素→过滤→装瓶→成品。

3号接种发酵（3号罐）：大球盖菇原料→清洗，消毒→晾干→装桶，压紧→加白糖→植入酵母菌→常温发酵（50 d）→植入长双歧杆菌→40 ℃发酵（30 d）→植入嗜热链球菌→47 ℃发酵（30 d）→酵素→过滤→装瓶→成品。

1.2.2 大球盖菇酵素DPPH自由基的清除作用[7]

在发酵过程中定期取样，发酵液经8 000 r/min离心后，取上清液用于测定。

准确称取20 mg DPPH·，用无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到质量浓度为80 μg/mL的DPPH·溶液，将酵素样品用离心除去固体物质。取1 mL测试液及1 mL的80 μg/mL DPPH·混匀后避光反应30 min，定容到5 mL。测定波长517 nm下吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，DPPH 自由基清除率（R1）按式（1）计算。

式中：A1为1 mL DPPH·溶液与1 mL提取液的吸光度；A2为1 mL提取液与1 mL无水乙醇的吸光度；A3为1 mL DPPH·溶液与1 mL无水乙醇的吸光度。

1.2.3 大球盖菇酵素清除超氧阴离子能力的测定[8]

取4.5 mL pH 8.2的Tris-HCl缓冲液，分别加入4.2 mL蒸馏水和0.3 mL 25 mmol/L邻苯三酚，混匀后25℃反应5 min，立即加入1 mL 8 mol/L的HCl，终止反应，定容至25 mL。在波长299 nm处测定吸光度A1；另取4.5 mL缓冲液，蒸馏水定容至25 mL，在波长299 nm处测定吸光度A2；另取4.5 mL缓冲液，加入1 mL酵素测试液、3.2 mL蒸馏水、0.3 mL邻苯三酚溶液，混匀后25 ℃反应5 min，立即加入1 mL 8 mol/L的HCl，终止反应，定容至25 mL。在波长299 nm处测定吸光度A3。同上步操作，仅不加邻苯三酚溶液，测得A4。超氧阴离子清除率（R2）按式（2）计算。

1.2.4 大球盖菇酵素清除羟自由基能力的测定[9]

在比色管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL酵素测试液、1 mL蒸馏水、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，摇匀，静置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，摇匀，静置30 min后稀释1倍，再于波长510 nm处测定吸光度A1；用蒸馏水代替水杨酸溶液，测得吸光度A2；用蒸馏水代替酵素测试液，测得吸光度A3。羟自由基清除率（R3）按式（3）计算。

1.2.5 酵素中自由基清除能力总评价

将3种自由基清除能力进行求和，然后平均值，即可得到酵素的自由基清除能力综合评价值（R）。

1.2.6 蛋白酶活性的测定

采用GB/T 23527—2009[10]的福林法进行测定。

1.2.7 纤维素酶活性的测定

采用GB/T 2583—2003[11]的还原糖法测定。

1.2.8 脂肪酶活性的测定

采用GB/T 23535—2009[12]的方法进行测定。

1.2.9 淀粉酶活性的测定

具体步骤如下：（1）取试管2批，分别作为供试管和空白管，各精密加入1%淀粉溶液1 mL，置37℃水浴保温5 min。（2）供试管中精密加入酵素样品1 mL，37 ℃水浴准确反应5 min后，立即加2 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴10 min；空白管中加入2 mL DNS试剂，37 ℃ 水浴反应5 min，精密加入酵素样品1 mL，摇匀，沸水浴10 min。在540 nm处测定吸光度。（3）在上述条件下，每分钟水解淀粉生成1 μmol麦芽糖的量，为1个淀粉酶活力单位（1 U=1 μ mol/min）。采用张思等[13]的公式计算淀粉酶活。

1.2.10 总酸的测定

采用GB/T 12456—2008[14]的方法进行测定。

1.2.11 有机酸的测定[15]

样品处理：取一定体积酵素原液，以8 000 r/min离心5 min，取上清液，适当稀释，过0.22 μm水膜，待用。

色谱条件：色谱柱Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；检测器，紫外检测器；流动相，5 mmol/L硫酸；检测波长，210 nm；流速，0.6 mL/min；柱温，30 ℃；进样量，20 μL。

2 结果与讨论

2.1 不同发酵方式对所制得的大球盖菇酵素DPPH自由基清除能力的影响

根据相关文献和实验室初步试验，建立了1.2.1所示的3种发酵方式，制备出大球盖菇酵素，每隔1周进行一次清除自由能力的测定。图1所示大球盖菇酵素分别在7，50和110 d时的DPPH·清除率。从图1中可以看出，1号自然发酵工艺所制得的大球盖菇酵素在起初7 d内DPPH·清除率很高，但随着自然发酵过程的进行，DPPH·清除率有所下降，到110 d时已经下降了近40%；而人工接种的2号和3号发酵工艺，DPPH·清除率相对比较稳定，虽然在起初DPPH·清除率低于自然发酵，但是后期DPPH·清除率高于自然发酵，2号接种发酵工艺所制得的大球盖菇酵素最高。说明人工接种更加有利于产品的质量控制。

图1 不同发酵方式对大球盖菇酵素DPPH自由基清除能力的影响

2.2 不同发酵方式对所制得的大球盖菇酵素超氧阴离子的清除能力的影响

按照1.2.1所建立的3种发酵方式进行大球盖菇酵素制备，在不同时间段测得大球盖菇酵素对超氧阴离子清除能力。如图2所示，1号自然发酵工艺制备的大球盖菇酵素对超氧阴离子清除能力明显低于人工接种2号和3号发酵工艺，2号工艺比较稳定，3号工艺在后期发酵略有降低，2种工艺在110 d最终的超氧阴离子清除能力基本一致，在35%左右。从酵素制备工艺控制角度考虑，2号发酵过程优于3号工艺。

图2 不同发酵方式对大球盖菇酵素超氧阴离子清除能力的影响

2.3 不同发酵方式对所制得的大球盖菇酵素羟自由基的清除能力的影响

按照1.2.1的方法制得的大球盖菇酵素进行羟自由基清除能力的测定，结果见图3。从图3中可以看出，3种发酵工艺所制得的酵素在羟自由基清除能力相差不大，1号自然发酵工艺所得到的酵素清除羟自由基能力略高，而且3种发酵工艺所得到的酵素这种清除能力在110 d内均相对稳定。

图3 不同发酵方式对大球盖菇酵素羟自由基清除能力的影响

2.4 3种发酵工艺对所制得的大球盖菇酵素的自由基清除能力的总评价

研究表明，通过3种发酵工艺试验，所制得的大球盖菇酵素对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基3种离子的清除能力有一定的差异。按照1.2.5的方法进行综合评价，结果见图4。图4显示，人工接种的2种工艺所制得的酵素综合清除自由基能力比自然发酵的提高16%左右。其中第2种工艺接种发酵最高，可以达到58.3%，说明人工接种的工艺具有较好的开发潜力。

2.5 不同工艺大球盖菇酵素蛋白酶活力比较

对按照方法1.2.1制得的大球盖菇酵素进行蛋白酶的分析测定，结果见图5。由图5可知，自然发酵的蛋白酶活力明显高于其他2种发酵方式的蛋白酶活力，先后加入安琪活性干酵母和长双歧杆菌的蛋白酶活力比先后加入安琪活性干酵母和德氏乳杆菌保加利亚亚种的蛋白酶活力稍高，其活力大小依次为1号自然发酵工艺＞3号接种发酵工艺＞2号接种发酵工艺。其中自然发酵蛋白酶活力最高，为75.432 U/mL。说明自然富集的菌群产蛋白酶能力强，而人工接种的酵母菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、长双歧杆菌、嗜热链球菌产蛋白酶的能力较弱。

图4 不同发酵方式对大球盖菇酵素清除自由基总能力的影响

图5 不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品中蛋白酶活力影响

2.6 不同发酵工艺对大球盖菇酵素纤维素酶活力的影响

由图6可知，不同发酵工艺制得的大球盖菇纤维酶活力有较大差异。1号自然发酵工艺制得的大球盖菇酵素中的纤维素酶活力比其他2种发酵方式的纤维素酶活力高，3种工艺的酵素纤维素酶活力大小依次为1号自然发酵＞3号接种发酵＞2号接种发酵。这说明自然富集的微生物菌群产纤维素酶的能力强，人工接种的几种菌株产纤维素酶的能力较弱。

2.7 不同发酵工艺对大球盖菇酵素脂肪酶活力比较

由图7可知，自然发酵的脂肪酶活力比其他2种发酵方式的脂肪酶活力低，2种混菌发酵的脂肪酶活力相差不大，其活力大小依次为2号接种发酵工艺≈3号接种发酵工艺＞1号罐，其中人工接种的发酵工艺的脂肪酶活力最高，为0.40 U/mL，是自然发酵脂肪酶活力的2倍。说明人工接种的酵母菌和嗜热链球菌对脂肪酶贡献较大。

图6 不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品中纤维素酶的活力影响

图7 不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品中脂肪酶活力影响

2.8 不同工艺大球盖菇酵素淀粉酶活力比较

如图8所示，不同发酵罐中的淀粉酶活力均不是很高。自然发酵的淀粉酶活力比其他2种发酵方式的淀粉酶活力低，先后加入安琪活性干酵母和长双歧杆菌的淀粉酶活力比先后加入安琪活性干酵母和德氏乳杆菌保加利亚亚种的淀粉酶活力稍低，其活力大小依次为2号发酵工艺＞3号发酵工艺＞1号发酵工艺。说明无论是自然发酵还是人工接种发酵，微生物产淀粉酶的能力均较弱。

图8 不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品中淀粉酶活力影响

2.9 不同发酵工艺大球盖菇酵素中总酸含量和有机酸种类的比较

由图9可知，不同发酵工艺中酵素的总酸含量存在明显的差异，其总酸含量大小依次为1号发酵工艺＞3号发酵工艺＞2号发酵工艺。其中自然发酵的1号工艺总酸最高可达22.65 g/kg，说明自然发酵的微生物菌群产酸能力强。而有机酸种类差别较大。1号工艺罐中的酵素含有大量的乳酸和乙酸；2号工艺罐中的酵素含有较多量的乙酸，另外还有少量的丙酸和微量的丁酸；3号工艺罐中的酵素也含有丰富的乙酸、较少的丙酸、少量的丁酸以及微量的乳酸和甲酸。3个不同工艺制得酵素中均含有丰富的乙酸，而且1号工艺罐中的酵素乳酸含量较高。这些有机酸可通过降低肠道pH、提高消化酶活性、增殖有益菌、抑制有害菌，从而调控肠道微生物平衡，起到一定调节肠道微生物，改善肠道健康的作用。

图9 不同发酵工艺对大球盖菇酵素产品总酸含量和种类的影响

3 结论与讨论

以大球盖菇为主要原料，采用自然发酵、酵母菌-德氏乳杆菌保加利亚亚种-嗜热链球菌先后顺序接种发酵、酵母菌-长双歧杆菌-嗜热链球菌先后顺序接种发酵3种工艺制备大球盖菇酵素，并对其发酵过程中的3种清除自由基能力、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和有机酸进行研究。结果表明，不同发酵工艺制得的大球盖菇酵素均有较强的抗氧化性，人工接种2种工艺发酵制备的酵素工艺更加稳定，清除DPPH自由基和超氧阴离子的能力要强于自然发酵，清除自由基总能力最高的是2号发酵工艺；人工接种发酵的脂肪酶和淀粉酶的活力分别提高了100%和85%；并且丰富了酵素中有机酸的种类。而自然发酵工艺在蛋白酶、纤维素酶、总酸和乳酸含量方面优于人工接种发酵，但其工艺稳定性较差，酵素产品质量不容易控制。总之，人工接种发酵工艺所制得酵素产品清除自由基能力、脂肪酶、淀粉酶、有机酸种类3个方面优于自然发酵，工艺更加稳定。这些研究将对大球盖菇制备成植物酵素的深加工具有重要意义。