正交试验优化染料木素-锌配合物合成工艺

王有娣，冯钰舒，唐旗羚，贺彦，钟铭君，徐娟娟

中山大学新华学院药学院（广州 510520）

染料木素（结构见图1）作为一种植物雌激素，主要存在于豆科植物中，如大豆、槐角、赤豆、山豆根中。

图1 染料木素结构图

有研究表明染料木素具有雌激素性质，可以抗氧化、诱发细胞程序性死亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等[1-2]。作为一种癌症的潜在化学预防剂，染料木素抗癌作用及机制具有广泛的应用前景[3]。有研究指出，染料木素与金属离子形成配合物后可以提高其生物利用度，增强其抗癌、抗氧化等活性[4-5]。课题组前期已经对染料木素及其锌配合物对乳腺癌和肺癌的体外抗癌活性进行了研究，结果显示染料木素及其配合物对乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性。根据目前已有的文献来看，染料木素-锌配合物的研究虽已有报道，但采用正交试验优化染料木素-锌配合物合成工艺还鲜见报道，故试验利用正交试验优选出染料木素-锌配合物的合成工艺条件，为天然产物染料木素的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

集热恒温加热磁力搅拌器（DF-1015型，郑州长城科工贸）；紫外可见分光光度计（UV-2201，日本岛津公司）；傅里叶红外光谱仪（Nicolet 5700，美国Thermo Nicolet）；电子天平（AUY120型，日本岛津公司）。

染料木素购自南京狄格尔医药科技有限公司（产品批号D2017042503A，纯度为99.8%），无水乙醇、醋酸锌、三乙胺等试剂均为分析纯。

1.2 方法

称取染料木素，用10倍量的无水乙醇作为反应溶剂，加热溶解，待染料木素完全溶解后，加入三乙胺调节反应pH，待反应pH稳定，加入醋酸锌，控制反应温度，回流搅拌一定时间，反应结束后，将反应液冷却至室温，以3 000 r/min离心2 min，沉淀用50%乙醇洗涤，洗涤3次后，于60 ℃烘干，称质量，计算配合物产率。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 反应温度的确定

一般而言，升高温度可以加快反应速度，由于温度太高可能会影响染料木素和金属离子的配位能力，也可能使反应溶剂（即无水乙醇）因为温度过高而沸腾。如图2所示，随着温度的升高，染料木素-锌配合物产率也随着增加，当温度在60 ℃时，产率最高，之后随着温度的升高，产率呈降低的趋势。因此选择最佳合成反应温度为60 ℃。

图2 反应温度对产率的影响

2.1.2 反应pH的确定

根据文献报道黄酮类化合物在碱性条件下较容易与金属离子进行配合反应，但反应pH过高可能会导致金属离子沉淀等问题[6]，故选用反应pH 7.0～11.0进行试验。由图3可知，随着pH的增大，染料木素-锌配合物的产率增加，当反应pH为9.0时染料木素锌配合物产率最高。此后，随着pH的增加，染料木素-锌配合物产率反而下降。因此选择最佳合成反应pH为9.0。

图3 反应pH对产率的影响

2.1.3 反应时间的确定

如图3所示，增加反应的时间，随着反应的逐渐完全，染料木素-锌配合物的产率升高，当反应时间在6 h时所得染料木素锌配合物产率最高，继续延长反应时间，染料木素-锌配合物的产率开始下降。因此选择最佳合成反应时间为6 h。

2.2 正交试验设计结果

根据单因素试验的结果，选择反应温度（A）、反应pH（B）、反应时间（C）三个因素作为考察的因素，每个因素选取三个水平，以染料木素锌配合物产率为衡量指标。因素水平表见表1。

图4 反应时间对产率的影响

表1 正交试验因素水平表

采用L9(34)进行正交试验，正交试验结果见表2，方差分析表见表3。从表2正交试验直观分析结果可以看出，各因素对配合物产率的影响程度不同，三个因素对产率的影响由大到小依次为反应pH（B）＞反应温度（A）＞反应时间（C）。从表3方差分析结果可以看出，三个因素对产率均无显著性影响。结合直观分析和方差分析结果，筛选出的染料木素锌配合物的最优合成方案为B2A2C2，即称取染料木素，用10倍量的无水乙醇溶解，60 ℃加热至完全溶解后滴加三乙胺，调节pH 9.0，pH稳定后加入醋酸锌，控制反应温度为60 ℃，回流搅拌6 h。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

2.3 合成工艺的验证

根据正交试验的结果，在最优的合成工艺B2A2C2条件下进行3次平行试验，通过配合物的产率验证最优合成工艺的可行性和合理性。试验结果显示，用反应pH 9.0、反应温度60 ℃、反应时间6 h的B2A2C2反应方案合成染料木素-锌配合物，产率为39.67%，合成得到的染料木素-锌配合物为淡黄色粉末。

2.4 染料木素-锌配合物的紫外光谱分析

将染料木素配体和染料木素-锌配合物进行紫外光谱分析，紫外光谱数据见表4。染料木素的特征紫外吸收峰为带Ⅰ352 nm和带Ⅱ269 nm，染料木素-锌配合物的两个吸收峰均向长波方向移动至381和299 nm。主要原因可能是染料木素和锌形成配合物是通过4位羰基、5位羟基和金属锌形成配位键，整个配合物分子的平面型增强，增大了共轭体系，故吸收带Ⅰ和Ⅱ会发生红移。紫外光谱结果可初步证明染料木素分子中的4位羰基和5位羟基参与了金属配位。

表4 染料木素-锌配合物的紫外光谱数据 nm

2.5 染料木素-锌配合物的红外光谱分析

将染料木素配体和染料木素-锌配合物进行红外光谱分析，其红外光谱数据见表5。染料木素的羟基吸收峰在3 411 cm-1左右，而锌配合物的羟基吸收峰移动至3 380 cm-1左右，原因可能是由5-OH参与配位引起的。染料木素的4位羰基峰在1 653 cm-1左右，而锌配合物的4位羰基峰在1 642 cm-1左右，向低波数移动，可能是由于4位羰基也参与了配位。与配体染料木素相比，配合后化合物在460 cm-1左右新增加了一个吸收峰，推测该峰可能是由金属Zn与O形成的Zn-O键伸缩振动引起的。红外光谱结果也可说明染料木素分子中的4位羰基和5位羟基参与了金属配位。

表5 染料木素-锌配合物的红外光谱数据

3 讨论

植物雌激素具有雌激素激动剂和阻断剂效应，对乳腺癌、前列腺癌、心血管病变等激素相关疾病的预防和治疗有良好的作用[7]。染料木素是一种异黄酮类的植物雌激素，课题组前期已经研究了染料木素及其锌配合物对乳腺癌和肺癌的体外抗癌活性，结果显示染料木素及其配合物对乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性，且染料木素-锌配合物的抗癌活性高于其配体染料木素[8]。

由染料木素本身的结构以及试验前的pH试纸测定显示，染料木素呈酸性，故染料木素在酸性环境中较稳定，与金属离子配位的能力较差，容易造成产率较低的问题。在强碱性条件下，染料木素与金属离子反应形成配合物的能力强，但碱性过强则容易造成染料木素的开环或者氧化，同时如果反应环境的pH过高也容易造成金属离子的沉淀。因此，综合考虑各种因素确定最终选定染料木素-锌配合物的合成pH范围为7.0～11.0，试验的结果也证明在pH 9.0时，反应产率最高。通过对正交试验结果的分析可知，影响产率的主要因素依次为pH（B）＞反应温度（A）＞反应时间（C），主要因素应取最好的水平，而次要因素则可根据成本、时间等方面考虑，由此得到各因素的最佳搭配为B2A2C2，即反应pH为9.0、反应温度为60 ℃、反应时间6 h。

4 结论

采用正交试验考察了不同因素对染料木素-锌配合物产率的影响。结果显示，染料木素-锌配合物的最佳合成工艺为：反应pH 9.0、反应温度60 ℃、反应时间6 h。在此条件下染料木素-锌配合物的平均产率可达39.67%。同时试验分析结果表明，三个影响因素中反应环境的pH对合成产率影响最大。对比染料木素与醋酸锌配合前后的紫外光谱和红外光谱可知，染料木素是通过4位羰基和5位羟基与锌金属离子进行配位的。