丙酮沉淀法提取普洱茶多糖工艺的响应面分析

董亮，胡丽，马懿

四川轻化工大学生物工程学院（自贡 643000）

茶多糖（TPS）是从茶叶中提取出的活性多糖的总称，是在茶多酚之后发现的又一类具有生理活性的重要物质[1]。药理研究表明，茶多糖具有降血糖、降血脂、降血压、抗癌、抗凝血、抗血栓、抗动脉粥样硬化、耐缺氧、防辐射、防治心血管疾病、增加冠状动脉血流量、增加机体免疫力等多种功能，尤其是其降血脂效果和免疫活性，可望成为预防和治疗糖尿病、心血管病，增加免疫功能的天然药物，也是茶叶保健性功能理化指标之一。茶多糖是普洱茶内含物质中的关键物质，茶多糖在枝叶粗老、等级低的茶叶中的含量比在嫩叶中的高，其含量的高低深刻影响着普洱茶的品质[2]。

茶多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波提取法、酶提取法、醇沉淀法、丙酮沉淀法、超滤法、超临界流体萃取法、稀酸浸提法、稀碱浸提法、CTAB沉淀法等。但目前关于普洱茶多糖的丙酮浸提工艺的研究尚未见报道，据谢爱泽等[3]采用丙酮沉淀法提取金花茶多糖的研究表明，采用丙酮沉淀法简便、快速，具有较强的实用性，且提取效果较好。

试验以云南普洱茶为原料，采用丙酮对茶溶液进行沉淀，选取浸提温度、沉淀剂用量、沉淀时间及离心时间4个因素做单因素试验，研究4个因素对茶多糖提取率的影响；在确定4个单因素中的最优水平基础上，利用Box-Behnken设计原理，选取浸提温度（A）、沉淀剂用量（B）、沉淀时间（C）、离心时间（D）4个因素为响应因子，以茶多糖提取率（R）为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验[4]。采用试验设计与处理软件Design-Expert 8.0.6进行二次曲面拟合，并最终确定出丙酮沉淀法提取普洱茶多糖的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

普洱茶（购于云南）。

丙酮、无水乙醇、无水乙醚（均为分析纯，重庆川东化工有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

台式高速离心机（RJ-TGL-1850，无锡市瑞江）；电子天平（AZ204N，常州市衡正）；中草药粉碎机（FW177，天津市泰斯特）；电子恒温水浴锅（DZKW-4，北京中兴伟业）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶多糖提取工艺流程

普洱茶中茶多糖的提取工艺流程为：普洱茶取样→粉碎后，过60目筛→热水浸提→离心取上清液→丙酮沉淀→离心（4 000 r/min）取沉淀→无水乙醇、丙酮、无水石油醚交替搅拌洗涤2次[5]→干燥→得粗茶多糖干品→测定提取率。

1.3.2 茶多糖提取率的测定

茶多糖提取率的计算如式（1）。

式中：m1为提取出的茶多糖质量，g；m为普洱茶原料质量，g。

1.3.3 茶多糖提取单因素试验

选取浸提温度（40，50，60，70和80 ℃）、沉淀剂用量（25，50，75，100和125 mL）、沉淀时间（9，12，15，18和21 h）和离心时间（5，10，15，20和25 min）4个单因子，考察对多糖提取率的影响。

1.3.4 响应面法优化提取工艺

运用BBD设计，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken Design试验设计原理[7]，选取浸提温度（A）、沉淀剂用量（B）、沉淀时间（C）、离心时间（D）4个因素为响应因子，以茶多糖提取率（R）为响应值，响应面分析试验设计为四因素三水平，以确定最佳丙酮沉淀法提取工艺条件，如表1所示。

表1 响应面优化试验因素水平编码表

2 结果与讨论

2.1 单因素结果

选取浸提温度、沉淀剂用量、沉淀时间、离心时间4个单因子，考察其对多糖提取率的影响。试验结果表明，沉淀剂用量75 mL、沉淀时间15 h、离心时间15 min、浸提温度60 ℃时，茶多糖提取率最大。

2.2 响应曲面法优化试验结果

2.2.1 响应模型的建立与分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面优化试验的数据进行二次多项式回归拟合，从而得到普洱茶茶多糖提取率（Y）对浸提温度（A）、沉淀剂用量（B）、沉淀时间（C）、离心时间（D）的回归模型方程为：Y=14.10-0.13A-0.13B-0.010C+0.20D+0.15AB+0.12AC-0.13AD-0.25BC-0.053BD-0.20CD-0.47A2-0.31B2-1.14C2-0.39D2。

回归模型具有较高显著性（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.299 0），此外分析结果中校正系数R2adj=0.995 9，R2=0.998 0。由此表明回归模型有较好拟合度，误差较小。因此模型可以反映响应值变化，同时回归方程可以对丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖的工艺参数进行分析和预测。由回归模型显著性检验分析表可知A、B、D、AB、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2对茶多糖提取率均有显著的影响（p＜0.05），而未标注出的因素影响不显著。根据F值大小可知，各因素对普洱茶茶多糖提取率影响大小顺序为离心时间（D）＞沉淀剂用量（B）＞浸提温度（A）＞沉淀时间（C），其中沉淀时间的影响最小。

2.2.2 响应面优化结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面优化试验的结果数据进行分析，得出回归模型等高线图和响应面图。等高线的形状反映的是因素间交互作用的强弱程度，等高线呈椭圆形或马鞍形时表示两因素之间的交互作用显著，呈圆形时则表示两因素之间的交互作用不显著[8]。通过观察和分析等高线的形状及响应面曲线的坡度走势等变化情况，可以直观反映出所考察因素每两者之间的交互作用对普洱茶茶多糖提取率的影响程度。其结果图1～图5所示。

图1中等高线呈近似椭圆形；由响应曲面图变化可知，沉淀时间与离心时间一定时，随着浸提温度增加，茶多糖提取率呈先增加后下降趋势，曲线变化较平缓。随着沉淀剂用量增加，茶多糖提取率呈先增加后下降趋势，且曲线较平缓。

图1 浸提温度与沉淀剂用量的等高线图与响应曲面图

图2 中等高线形状呈明显椭圆形；在响应曲面图变化中，沉淀剂用量与离心时间一定时，随着沉淀时间增加，茶多糖提取率呈先升高后下降趋势，且曲线较陡。随着浸提温度升高，茶多糖提取率呈先增加后下降趋势，且曲线较平缓。

图2 浸提温度与沉淀时间的等高线图与响应曲面图

图3 中等高线形状呈近似椭圆形；在响应曲面图变化中，沉淀剂用量与沉淀时间一定时，随着离心时间增加，茶多糖提取率呈先升高后趋于平缓趋势，且曲线较陡。随着浸提温度增加，茶多糖提取率呈先升高后下降趋势，且曲线较平缓。

图3 浸提温度与离心时间的等高线图与响应曲面图

图4 中等高线形状呈明显椭圆形；在响应曲面图变化中，浸提温度与离心时间一定时，随着沉淀时间增加，茶多糖提取率先增加后减少，且曲线较陡。随着沉淀剂用量增加，茶多糖提取率呈先升高后趋于平缓趋势，且曲线较平缓。

图4 沉淀剂用量与沉淀时间的等高线图与响应曲面图

图5 中等高线形状呈近似椭圆形；在响应曲面图变化中，浸提温度与沉淀时间一定时，随着离心时间增加，茶多糖提取率先增加后减少，且曲线较陡。随着沉淀剂用量增加，茶多糖提取率也先增加后减少，且曲线较平缓。

图6中等高线形状呈明显椭圆形；在响应曲面图变化中，浸提温度与沉淀剂用量一定时，随着离心时间增加，茶多糖提取率先增加后几乎不变，且曲线较陡。随着沉淀时间增加，茶多糖提取率先增加后减少，且曲线较陡。

图1、3、5的3D曲线最为平滑，等高线呈近似椭圆形，表明浸提温度与沉淀剂用量、浸提温度与离心时间、沉淀剂用量与离心时间相互之间交互作用较显著；而图2、4、6的3D曲线最陡，等高线呈明显椭圆，表明浸提温度与沉淀时间、沉淀剂用量与沉淀时间、沉淀时间与离心时间相互之间交互作用极显著。

图5 沉淀剂用量与离心时间的等高线图与响应曲面图

图6 沉淀时间与离心时间的等高线图与响应曲面图

3 结论

以普洱茶为原料，采用丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖的方法，研究丙酮提取茶多糖工艺的最佳条件，并使用响应曲面优化提取工艺。结果表明，茶多糖提取最佳工艺条件为：浸提温度63.81 ℃，沉淀剂用量83.72 mL，沉淀时间16.48 h，离心时间18.29 min。在茶多糖提取试验过程中离心时间是最大影响因素。在响应面选取出的最佳条件下进行试验，实际测得的茶多糖的平均提取率为14.155 4%，而与预测的理论值14.169 2%相比基本一致。故采用响应曲面回归模型对丙酮沉淀法提取普洱茶茶多糖进行的工艺优化有较好效果。