响应面优化复合酶法制备杏鲍菇抗氧化物

裴云成 ，朱丹，李文香，郑华 ，程凡升*

1. 青岛农业大学食品科学与工程学院（青岛 266109）；2. 青岛农业大学生命科学学院（青岛 266109）；3. 青岛农研生物科技有限公司（青岛 266109）

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）别名刺芹侧耳，菌肉肥厚，并且具有杏仁香味[1]。杏鲍菇含大量营养物质，如各种糖类、蛋白质和维生素等，还含有多种生物活性化合物，脂肪含量低，具有抗病毒、抗疲劳、抗氧化、防止动脉硬化的作用[2]。它还可降低癌症发生几率[3]。新鲜杏鲍菇含有大量水，容易发生褐变腐烂，不易保藏[4]，所以杏鲍菇产品的深加工技术有待于深入研究。选择合适、实用的加工处理方法对减少新鲜杏鲍菇损失，保持良好商品性状和营养价值具有重要意义[5]。

近年来国内外关于杏鲍菇相关产品的开发，有效成分的提取、研究及利用逐渐成为热点[6]。而关于杏鲍菇有效成分的研究，国内外主要集中在杏鲍菇多糖和胞外酶上[7]。有张梦甜等[8]研究杏鲍菇子实体的营养含量和功能成分，暴增海等[9]研究对子实体和菌丝包含的营养物质的对比情况。杨立红等[10]在杏鲍菇子实体的基础上，经分离和纯化得到杏鲍菇多糖。研究表明，多数杏鲍菇产品属于粗制产品，使杏鲍菇含有的活性成分无法充分利用。杏鲍菇本身含有较多抗氧化活性物质[11]，杏鲍菇抗氧化物是近几年来才开发的新型产品，其提取方法有水提法、碱提法、酶提法、微波提取法、超声提取法[12]，但复合酶法提取尚鲜见报道。在制备杏鲍菇抗氧化物的加工方法中，研究用酶解多糖和多肽的酶同时对杏鲍菇进行酶解，从而提高杏鲍菇抗氧化产品品质，为杏鲍菇深加工技术的深入开发提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇（青岛市城阳批发市场）；菠萝蛋白酶（酶活力500 U/mg）、胃蛋白酶（酶活力3 250 U/g）、纤维素酶（酶活力3 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力250 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力800 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活力60 000 U/g）、果胶酶（酶活力40 U/mg）、糖化酶（酶活力100 000 U/g）（北京索莱宝科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；无水乙醇（AR）、邻苯三酚（AR）、FeCl2（AR）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（奥豪斯国际贸易（上海）有限公司）；二列六孔电热恒温水浴锅（龙口市先科公司）；TGL-16 M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；打浆机（九阳）；UV-2000紫外可见分光光度计（尤尼克（上海）仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 多肽酶的筛选方法

试验分3组，选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶在加酶量8 000 U/g及其最适pH及温度下水浴酶解1.5 h，沸水浴10 min灭酶，离心取上清液，所得上清液即为杏鲍菇多肽酶解液。以DPPH·清除率为指标，筛选酶解杏鲍菇的最佳蛋白酶。

1.3.2 多糖酶的筛选方法

将1.3.1中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶改为纤维素酶、果胶酶和糖化酶，步骤相同。

1.3.3 加酶量的确定方法

在胃蛋白酶和纤维素酶的最适pH（1.96和5.52）和酶解温度（37和50 ℃）及底物浓度1∶20（g/mL），酶解时间1.5 h，研究加酶量对DPPH·清除率的影响，分为4 000，6 000，8 000，10 000和12 000 U/g[13]5个梯度，确定最适加酶量。

1.4 单因素试验方法

在最佳酶组合基础上，在其他试验条件相同前提下，研究不同底物浓度（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））对杏鲍菇抗氧化物活性的影响；同理在其他试验条件相同前提下，研究不同pH（1.5，2.5，3.5，4.和5.5）和不同酶解时间（0.1，0.2，0.4，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h）及不同温度（4，12，25，37，42，47，52和57 ℃）对杏鲍菇抗氧化物活性的影响，以DPPH·清除率为指标。

1.5 DPPH·清除能力的测定方法

依次加入试剂，充分混匀，室温黑暗处静置反应30 min，在517 nm处测定[14]。

DPPH·清除率=[1-（Aa-Ab）/A0]×100% （1）

式中：Aa为样品吸光度；Ab为样参吸光度；A0为对照吸光度。

1.6 响应面试验方法

综合单因素试验结果，选取酶解温度、pH、胃蛋白酶加酶量、纤维素酶加酶量为变量，分别以A、B、C、D表示，DPPH·清除率Y为响应值，以-1、0、1分别代表变量的水平，确定杏鲍菇酶解液抗氧化活性的最佳制备工艺条件，试验设计的因素水平如表1。

1.6.1 ·OH清除能力的测定方法

在试管中依次加入3.5 mL去离子水，0.5 mL水杨酸-乙醇溶液，0.5 mL样品，0.5 mL FeCl2溶液，5 mL H2O2，摇匀，在510 nm处测定吸光度[15]。

式中：A1为样品的吸光度；A2为蒸馏水替代9 mmoL/L的FeCl2的吸光度；A3为去离子水替代样品溶液的吸光度。

1.6.2 O2-清除能力的测定方法

采用邻苯三酚自氧化法[16]。以等体积0.01 mol/L HCl代替邻苯三酚为空白调零，对照组为等体积二次水代替样品。对照品为VC。

式中：A0为对照组的吸光度；A为样品组的吸光度。

表1 响应面试验因素水平编码

2 结果与分析

2.1 酶的筛选结果

图1 多肽酶的DPPH清除率结果

图2 多糖酶的DPPH清除率结果

由图1和图2表明，生杏鲍菇加酶酶解后效果更好，杏鲍菇煮熟后进行酶解清除率多数比生杏鲍菇不加酶高，说明煮熟后的杏鲍菇经过酶解也存在抗氧化活性，但抗氧化活性不如生杏鲍菇加酶酶解后效果好。多肽酶抗氧化活性大小为：胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞菠萝蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。而多糖酶抗氧化活性大小依次为：纤维素酶＞果胶酶＞糖化酶。由此可以看出，经胃蛋白酶和纤维素酶酶解后的杏鲍菇酶解液抗氧化活性最好。

2.2 加酶量的确定结果

随着加酶量增加，加入纤维素酶后的酶解液抗氧化活性越来越强，在10 000 U/g时达到最大值，而胃蛋白酶在6 000 U/g时达到最大值，随后逐渐降低，但加酶量12 000 U/g时清除率又提高，由于加酶量太多，不符合经济效益且清除率并没有超过最大值，因此选择纤维素酶加酶量为10 000 U/g，选择胃蛋白酶加酶量为6 000 U/g。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 不同底物浓度对抗氧化活性的影响

由图3（a）可知，杏鲍菇溶液随着底物浓度逐渐降低，其DPPH清除率也降低，杏鲍菇酶解液的DPPH清除率为最大值时的底物浓度为1∶10（g/mL）。表明较高的底物浓度对抗氧化活性有很大影响，所以选择1∶10（g/mL）为最佳底物浓度。

2.3.2 不同pH对抗氧化活性的影响

由图3（b）可知，pH增加到2.5时，清除率急剧下降，达到最低值，之后随着pH逐渐增加，清除率也逐渐上升，但没有超过最高值，综合考虑最佳pH为3.5。

2.3.3 不同酶解时间对抗氧化活性的影响

由图3（c）可知，10～40 min杏鲍菇酶解液的DPPH清除率普遍很低，说明时间太短反应不够充分，清除率随着酶解时间增加而上升，1.5 h时清除率突然降低，到2 h时清除率开始逐渐升高，直到2.5 h后趋于平缓，选择最佳酶解时间为2.5 h。

2.3.4 不同温度对抗氧化活性的影响

由图3（d）可知，温度逐渐升高，随之清除率也逐渐上升，于47 ℃时清除率达到最大值，之后下降，在57 ℃时又有所提高，但没有超过最大值，考虑经济效益，因此确定最佳酶解温度为47 ℃。

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面试验结果及分析

表2为响应面试验设计与结果。

2.4.2 回归模型的建立与显著性分析

通过Design Expert 8.0.5响应面分析软件对试验结果进行分析，得到模型所对应的回归方程为：Y=73.28+2.34A-0.14B+1.72C+0.37D-1.07AB+0.98AC-1.47AD+1.88BC-0.52BD-1.00CD-4.17A2-3.45B2-3.39C2-2.96D2。其中，Y表示DPPH·清除率，A表示酶解时间，B表示pH，C表示胃蛋白酶加酶量，D表示纤维素酶加酶量。

图3 单因素对抗氧化活性的影响

表2 响应面设计及结果

对响应面试验结果进行方差分析，所得结果见表3。由表3可以看出，回归模型呈现极显著（p＜0.01），模型失拟项为0.111 3＞0.05，无显著性影响，说明模型拟合程度较好，对试验结果的分析可采用此回归方程代替试验，其校正决定系数为0.933 0，有93.30%的试验数据的变异性符合这种回归模型的规律。因此，回归方程能较好描述响应值与各因素之间的关系，各试验因子对试验的影响关系是A＞C＞D＞B，即酶解温度＞胃蛋白酶加酶量＞纤维素酶＞pH。4个因素中酶解温度和胃蛋白酶加酶量对试验结果有极显著影响（p＜0.01）。交互项中BC显著性较好，说明pH和胃蛋白酶加酶量之间相互作用对DPPH·清除率影响较大。

表3 响应面方差分析

优化条件的结果见图4。

图4（A）表明酶解温度50 ℃、纤维素酶加酶量10 000 U/g，胃蛋白酶加酶量与酶解pH相互作用对杏鲍菇DPPH·清除率的影响。胃蛋白酶加酶量4 000～6 400 U/g、酶解pH 2.0～3.8时，两者之间存在协同作用，DPPH·清除率随着胃蛋白酶加酶量和pH增加而上升；而胃蛋白酶加酶量6 400～8 000 U/g、酶解pH 3.8～ 5.0时，随着2个因素的增加，清除率逐渐下降。同理图4（B）中，固定纤维素酶加酶量10 000 U/g及酶解pH 3.5，在胃蛋白酶加酶量4 000～6 400 U/g，酶解温度42～48 ℃时，DPPH·清除率随着胃蛋白酶加酶量和酶解温度增加而上升；而2个因素再增加时，清除率逐渐下降。

胃蛋白酶加酶量和酶解温度分别为6 000 U/g和50℃时，纤维素酶加酶量与pH交互作用对DPPH·清除率的影响如图4（C）所示。纤维素酶加酶量保持不变时，随着pH增加，清除率先增加后降低；同理pH一定时，纤维素酶加酶量变化，清除率的变化也同样如此。图4（D）中表明胃蛋白酶加酶量和pH分别为6 000 U/g和3.5时，纤维素酶加酶量维持恒定值时，随着温度增加，清除率先增加后趋于平缓；温度一定时，清除率随着纤维素酶加酶量的增加而上升随之趋向于平缓。

图4（E）表明胃蛋白酶加酶量和纤维素酶加酶量分别为6 000和10 000 U/g，酶解温度与酶解pH两者之间的关系对DPPH·清除率的影响。温度保持不变时，pH逐渐增加，清除率随之增加到最大值而后降低；pH一定时，清除率随着温度增加而增加之后逐渐趋于平缓。图4（F）中温度50 ℃、pH 3.5时，DPPH·清除率随着纤维素酶和胃蛋白酶加酶量的增加而增加，然后趋向平缓。

图4 两显著交互效应对DPPH·清除率的影响

2.4.3 最优化工艺条件

通过Design Expert 8.0.5响应面分析软件处理数据和进行分析，得出杏鲍菇酶解液抗氧化活性最佳条件为：酶解温度52 ℃，pH 3.4，胃蛋白酶加酶量6 848 U/g，纤维素酶加酶量9 487 U/g。在此条件下DPPH·清除率达72.2%。

通过3次验证试验发现，在此条件下所得杏鲍菇酶解液抗氧化活性依次为71.6%，72.9%和72.6%，平均提取率为72.2%，与模型预测数值较接近；表明试验的研究工艺具有很好稳定性。

2.4.4 清除·OH和O2-·结果分析·

OH清除能力的测定结果为62.4%，O2-·清除能力测定结果为68.7%，2个指标结果都较高，因此证明模型能很好地预测试验结果。

3 讨论与结论

近年来杏鲍菇产品深加工技术发展越来越迅速，杏鲍菇产品的种类和功能也越来越丰富。研究采用复合酶法制备杏鲍菇抗氧化物，其效果极显著。复合酶法是2种酶甚至是多种酶共同酶解天然产物，能提高抗氧化产物活性。对杏鲍菇的研究已非常深入，但主要集中在多糖级分的提取[17]，Li等[18]研究杏鲍菇中提取多糖方法的比较；Zhang等[19]研究杏鲍菇细胞中多糖抗氧化性；Ayala-Zavala[20]及Zou等[21]研究抗氧化活性的作用。而制备杏鲍菇抗氧化物过程中复合酶法应用的文献很少。施瑛等[22]研究复合酶法提取紫菜藻红蛋白工艺，证实多种酶同时添加比只添加一种酶的效果好。Liu等[23]研究复合酶处理能够提高可溶性结合物的抗氧化活性。复合酶法这一方法制备杏鲍菇抗氧化物确实能起到良好效果。

研究表明，分别在选取的5种多肽酶和3种多糖酶中，胃蛋白酶和纤维素酶的抗氧化活性效果最好。在单因素试验的基础上进行响应面优化，把酶解温度、pH、胃蛋白酶加酶量及纤维素酶加酶量这4个因素作为影响因子进行优化，结果显示酶解温度和胃蛋白酶加酶量对试验结果有极显著影响，pH和胃蛋白酶加酶量的相互作用对DPPH·清除率的影响较大，得出优化结果为：酶解温度52 ℃，pH 3.4，胃蛋白酶加酶量6 848 U/g，纤维素酶加酶量9 487 U/g。在此条件下，DPPH·清除率达72.2%，经过3次试验验证表明模型能很好预测试验结果。由此可知，复合酶法制备杏鲍菇抗氧化物效果好，不仅可使杏鲍菇酶解液酶解后的DPPH清除率大幅度提高，而且反应条件温和，经济效益达到最佳，为杏鲍菇深加工产品增添新的产品形式。